WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 |

Создание иммунохимических реагентов для выявления caga-антигена helicobacter pylori и антител против него

-- [ Страница 2 ] --

Работа с клеточными культурами. Клетки постоянной миеломной линии 653А, гибридные клетки, полученные в результате слияния спленоцитов иммунизированных мышей с миеломным партнером, а также первичные культуры мышиных перитонеальных макрофагов культивировали в планшетах (Nunc) при 37°С, 100% влажности, в атмосфере с 8% CO2. Базовая культуральная среда содержала 90% DMEM и 10% сыворотки крупного рогатого скота («Биолот», Санкт-Петербург). Клетки криоконсервировали в среде, состоящей из 45% DMEM, 45% сыворотки и 10% диметил-сульфоксида (Sigma), и хранили в жидком азоте.

Иммунизация мышей. Мышей F1(SJL/JxBALB/c) иммунизировали препаратами рекомбинантных белков, растворенных в фосфатно-солевом буфере или заключенных в акриламидный гель. Антиген эмульгировали в полном (для первой иммунизации) или неполном (для второй иммунизации) адъюванте Фрейнда (Sigma) и инъецировали животным в дозе 30 мкг внутрибрюшинно. Для последующей антигенной стимуляции белок растворяли в фосфатно-солевом буфере и инъецировали животным в дозе 10 мкг внутрибрюшинно. Через 7 дней после третьей иммунизации у мышей брали пробы крови, и в сыворотках определяли титр антител к рекомбинантным фрагментам белка CagA.

Создание гибридом. Слияние спленоцитов иммунизированных мышей и клеток миеломной линии 653А проводили с использованием 50% раствора полиэтиленгликоля ПЭГ-1000 (Sigma) по стандартной методике (Galfre et al.., 1977). Для селекции гибридов в среду добавляли гипоксантин, аминоптерин и тимидин (Sigma). Культуральные надосадки тестировали методом непрямого твердофазного ИФА.

Культуры, продуцирующие антитела против CagA, клонировали методом лимитирующих разведений, тестировали, наращивали в массовой культуре, и часть клеток замораживали, а часть – прививали в брюшную полость мышам F1(SJL/JxBALB/c) для получения асцитов. Клетки из собранных асцитов осаждали центрифугированием. Фракцию иммуноглобулинов (Ig) выделяли из асцитической жидкости осаждением полунасыщенным раствором сульфата аммония. МКАТ очищали методом аффинной хроматографии на белок-G-сефарозе (Pharmacia).

Варианты ИФА. Оценку титра антител в сыворотках мышей, отбор гибридом-продуцентов МКАТ и исследование специфичности МКАТ выполняли с помощью непрямого твердофазного ИФА. В качестве антигенов использовали аффинно очищенные рекомбинантные белки rCagAfr.1-4. Выявляющим реагентом служил конъюгат аффинно очищенных кроличьих антител против мышиных Ig с пероксидазой. Во всех вариантах ИФА пероксидазную активность определяли с использованием субстрат-хромогенной смеси (3,3`,5,5`-тетраметилбензидин и H2O2, «Хема-Медика», Санкт-Петербург). После остановки реакции оптическую плотность раствора регистрировали при длине волны 450 нм (ОП450). Каждый эксперимент выполняли в трех повторностях.

Рекомбинантные фрагменты CagA, меченные биотином, использовали при исследовании взаимного расположения эпитопов, распознаваемых МКАТ, методом ингибиторного ИФА (Nagata et al., 2004), а также при отборе МКАТ, способных распознавать молекулы антигена в растворе. Выявляющим реагентом служил конъюгат стрептавидин-пероксидаза (Sigma).

При разработке серологической системы непрямого ИФА для выявления антител против CagA тестировали 80 образцов сыворотки крови. Антитела, связавшиеся с адсорбированными на твердой фазе рекомбинантными фрагментами CagA, выявляли коктейлем меченных пероксидазой МКАТ против легких - и -цепей Ig человека (для выявления суммарных антител) или конъюгатом МКАТ против тяжелой -цепи человека (для определения фракции антител класса IgA). Реакцию считали положительной в случае, если значение ОП450 превышало фоновый показатель не менее, чем в три раза. Специфичность теста проверяли методом ингибиторного ИФА, предварительно инкубируя сыворотки с антигеном. Интактные сыворотки использовали в качестве контроля. Значения ОП450 сравнивали с помощью парного двухвыборочного t-критерия.

Суммарные антитела против CagA в тех же 80 сыворотках крови выявляли также с помощью прямого ИФА с использованием набора ХеликоБест-антитела («Вектор-Бест», Новосибирск) – единственной ИФА-системы для определения антител против CagA, разработанной и сертифицированной в России. Антитела, связавшиеся с адсорбированным на твердой фазе антигеном, выявляли с помощью того же антигена, меченного пероксидазой. Результаты выявления антител против CagA в сыворотках, полученные с помощью двух вариантов ИФА, сравнивали по общепринятым критериям (Altman, Bland, 1994).

Двухцентровый вариант ИФА, предназначенный для выявления белка CagA, моделировали с использованием раствора очищенного рекомбинантного фрагмента CagA с концентрацией 1 мкг/мл. Чувствительность теста оценивали методом титрования раствора антигена. В этом варианте ИФА на твердую фазу адсорбировали МКАТ, предназначенное для захвата антигена из раствора. Антиген, связанный МКАТ на твердой фазе, выявляли вторым МКАТ, меченным пероксидазой. Разработанный вариант ИФА апробировали с использованием лизатов клинических изолятов H. pylori. Бактерий лизировали в денатурирующих условиях в присутствии мочевины. После центрифугирования надосадки уравновешивали по концентрации суммарного белка и исследовали в двухцентровом ИФА. Тест повторяли трижды, и средние значения ОП450 для cagA-позитивных и cagA-негативных изолятов сравнивали с помощью двухвыборочного t-критерия.

Иммуноблоттинг. Метод иммуноблоттинга использовали при характеристике рекомбинантных белков, а также при исследовании специфичности МКАТ и их способности выявлять нативный белок CagA H. pylori. Лизаты рекомбинантных бактерий E. coli или H. pylori подвергали электрофоретическому разделению в ДСН-ПААГ. Белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Sigma) с помощью полусухого электропереноса. Мембраны инкубировали в растворе МКАТ (0,1-1 мкг/мл), затем иммунные комплексы выявляли конъюгатом кроличьих антител против мышиных Ig с пероксидазой. Пероксидазную активность, связанную с мембраной, проявляли с помощью хромогенной смеси 4-хлорнафтола (Sigma) и H2O2.





Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью программ Microsoft Excell 2007 и Statistica 8. Основным методом сравнения результатов ИФА был двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями. При анализе связанных данных использовали парный t-тест. Различия с уровнем значимости p<0,05 считали достоверными.

  1. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ последовательностей белков CagA и конструирование праймеров. С помощью in silico анализа репрезентативной выборки аминокислотных последовательностей CagA в полипептидной цепи цитотоксина выявлены 3 области с различными свойствами. N-концевая область молекулы CagA (а.к.о. 1 – 595, Рис.1а,б) высоко консервативна (более 95% консенсусных позиций) и, вероятно, является низкоиммуногенной, поскольку на её протяжении вероятность образования суперскрученной альфа-спирали не превышает уровень 0,5. Центральный сегмент молекулы цитотоксина (а.к.о. 596 – 768) также консервативен. Вероятность образования суперспирали на этом участке существенно превышает критический уровень 0,5, что позволяет прогнозировать высокую иммуногенность данной области молекулы. C-терминальная область CagA характеризуется низкой потенциальной иммуногенностью и содержит участок с высокой вариабельностью последовательности.

На основе анализа консервативности нуклеотидных последовательностей, фланкирующих участки гена cagA, кодирующие указанные области, подобраны олигонуклеотидные праймеры амплификации и направленного клонирования фрагментов гена cagA (Рис. 1в).

Создание и характеристика генетических конструкций. С помощью полимеразной цепной реакции амплифицированы четыре перекрывающиеся фрагмента гена cagA с молекулярными размерами около 1730, 1270, 1000 и 2000 п.н. (Рис. 1в,г). Первый фрагмент кодирует консервативную низкоиммуногенную область цитотоксина, второй - соответствует высокоиммуногенному консервативному участку. Третий фрагмент кодирует вариабельную низкоиммуногенную область цитотоксина, а четвертый - включает в себя последовательности второго и третьего фрагментов.

Рис. 1. A-B: Схема, иллюстрирующая алгоритм выбора фрагментов гена cagA для амплификации и клонирования на основе анализа распределения консервативности (А- диаграмма сходства) и потенциальной иммуногенности (Б – диаграмма распределения вероятности образования суперскрученной спирали) в аминокислотной последовательности CagA. По оси абсцисс указаны номера а.к.о., по оси ординат – уровень сходства (на А) и вероятность образования суперспирали (Б). В - взаиморасположение праймеров, разработанных для амплификации фрагментов гена cagA, и последовательностей этих фрагментов. Г: Электрофоретическое разделение продуктов амплификации фрагментов гена cagA H. pylori в агарозном геле. Fr.1, fr.2, fr.3 и fr.4 - продукты ПЦР, молекулярный размер 1730, 1270, 1000 и 2000 п.н., соответственно. M – ДНК-маркер.

В результате клонирования продуктов амплификации получены плазмидные конструкции pQE31-cagAfr.1, pQE31-cagAfr.2, pQE30-cagAfr.3 и pQE31-cagAfr.4 (5138, 4682, 4406 и 5414 п.н.). Секвенирование плазмид и последующий анализ последовательностей подтвердили, что все четыре вставки являются фрагментами гена cagA H. pylori и находятся в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей гексагистидиновый мотив, расположенной в 5`-области от сайта клонирования. Фрагменты cagAfr.1-3 были амплифицированы на общей матрице ДНК, выделенной из одного биоптата, поэтому их нуклеотидные последовательности были объединены в одну последовательность длиной 3345 п.н. Эта последовательность гена cagA была депонирована в базе данных GenBank под номером FJ428215. Четвертый фрагмент (cagAfr.4) был амплифицирован с ДНК, изолированной из биоптата другого пациента. Его нуклеотидная последовательность (1941 п.н.) отличалась по ряду позиций от последовательности FJ428215 (сходство 94,9%). Она была аннотирована отдельно, под номером GQ892188. В результате виртуальной трансляции частичных нуклеотидных последовательностей гена cagA FJ428215 и GQ892188 установлены и депонированы в GenBank аминокислотные последовательности белков CagA ACR15106 (1114 а.к.о) и ACX37408 (646 а.к.о.), соответственно.

Создание штаммов-продуцентов, получение и очистка рекомбинантных белков. В результате трансформации бактерий линии E. coli M15[pREP4] перечисленными выше плазмидами созданы четыре новых штамма бактерий. При индукции изопропилтиогалактозидом культуры-продуценты синтезировали рекомбинантные белки - rCagAfr.1, fr.2, fr.3 и fr.4 с молекулярной массой 65, 44, 39 и 75 кДа, соответственно (Рис. 2а). Эти значения совпадали с расчетными данными, полученными на основании анализа нуклеотидных последовательностей конструкций. Рекомбинантные белки реагировали с МКАТ к гексагистидиновому мотиву (Рис. 2б), что свидетельствовало об успешном создании химерных полипептидов. Денситометрический анализ фореграмм показал, что относительный уровень экспрессии рекомбинантных полипептидов составил 5-20% массы тотального белка в клетках-продуцентах. В результате очистки рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии получены препараты высокой степени чистоты (до 97%). Средний выход чистых целевых белков составлял около 15 мг/л бактериальной культуры.

Рис. 2. Выявление рекомбинантных белков в клетках E. coli. A. Электрофоретическое разделение лизатов бактерий, продуцирующих белки rCagAfr.1, fr.2, fr.3 и fr.4 с молекулярным весом 65, 44, 39 и 75 кДа, соответственно (указаны стрелками). Б. Выявление белков rCagAfr.1, fr.2, fr.3 и fr.4, содержащих гексагистидиновый мотив, с помощью антител к гексагистидину.

Анализ последовательностей рекомбинантных белков. Анализ последовательностей белков rCagAfr.1-4, ACR15106 и ACX37408 выявил, что они представляют «западный» тип CagA-белка, наиболее характерный для штаммов H. pylori, распространенных в Европе и Северной Америке (Xia et al., 2009). Расчет вероятности образования суперспирали в последовательностях rCagAfr.1-4 показал, что рекомбинантные фрагменты полностью воспроизводят профиль распределения потенциальной иммуногенности на соответствующих участках полноразмерного белка CagA. Рекомбинантный фрагмент rCagAfr.1 представляет собой низкоиммуногенный N-концевой участок цитотоксина CagA, белок rCagAfr.2, вероятно, несет иммунодоминантные эпитопы молекулы CagA, а фрагмент rCagAfr.3 представляет низкоиммуногенный C-концевой участок CagA. Наконец, в последовательности фрагмента rCagAfr.4 представлены одновременно центральный и C-концевой участки цитотоксина, а его потенциальная иммуногенность высока. Таким образом, рекомбинантные фрагменты rCagAfr.1-4 в совокупности представляют практически полную последовательность белка CagA, при этом высоко- и низкоиммуногенные эпитопы цитотоксина оказываются изолированными в разных фрагментах.

 Рис. 3. Схема взаиморасположения последовательностей рекомбинантных-2

Рис. 3. Схема взаиморасположения последовательностей рекомбинантных фрагментов rCagAfr.1, 2, 3 и 4, а также частичных последовательностей белков CagA, размещенных в GenBank, - ACR15106 и ACX37408. His6 – N-терминальный гексагистидиновый мотив. 1 и 1114 – номера а.к.о. в последовательности ACR15106, начиная с N-конца.

Выявление антител против CagA в сыворотках. Очищенные рекомбинантные фрагменты rCagAfr.1-3 были использованы для разработки ИФА-системы, выявляющей антитела против CagA в сыворотке крови человека. Исследование 80 сывороток показало, что 46,3% (37/80) образцов содержали антитела, которые реагировали по крайней мере с одним из трех фрагментов, при этом в большинстве случаев (94,6%, 35/37) сыворотки взаимодействовали с rCagAfr.2. Лишь два образца (5,4%, 2/37) дали слабую реакцию с rCagAfr.1 и rCagAfr.3 при отсутствии сигнала на rCagAfr.2. Эти данные экспериментально подтверждают предсказанные параметры иммуногенности белков: наибольшей потенциальной иммуногенностью, в соответствии с расчетами, обладал именно рекомбинантный фрагмент rCagAfr.2, который и был выбран для дальнейшей работы. Специфичность выявления антител в сыворотках с использованием белка rCagAfr.2 была подтверждена с помощью ингибиторного ИФА. Предварительная инкубация сывороток с антигеном снижала эффективность образования иммунных комплексов (p<0,05, Рис. 4). Таким образом, результаты тестирования позволили отнести 35 сывороток к анти-CagA-позитивным, 45 – к негативным (Табл. 1).

Изотипический спектр антител против белков H. pylori считается важным прогностическим признаком (Castillo-Rojas et al., 2002; Bhat et al., 2005; Vorobjova et al., 2006, 2008; Лазебник и др., 2006), что определяет необходимость разработки вариантов ИФА, позволяющих оценивать вклад различных фракций иммуноглобулинов в уровень суммарных антител против CagA. Эта задача может быть решена с использованием в качестве выявляющих реагентов МКАТ против отдельных изотипов и субизотипов Ig человека. Так, предложенная ИФА-система была модифицирована для выявления анти-CagA антител изотипа IgA за счет использования конъюгата специфических МКАТ против тяжелых -цепей. Тестирование сывороток в этой системе показало, что из 35 образцов, в которых были выявлены суммарные антитела против CagA, IgA антитела были обнаружены в 24 сыворотках (68,5%).

 Рис. 4. Влияние предварительной инкубации сывороток с антигеном на выявление-3

Рис. 4. Влияние предварительной инкубации сывороток с антигеном на выявление суммарных антител против CagA. Данные по 35 образцам. Контроль – интактные сыворотки. Ингиб. – образцы, преинкубированные с rCagAfr.2. Указаны средние, максимальные и минимальные значения ОП450, а также 95%-доверительные интервалы.

Уровень суммарных антител против CagA в тех же сыворотках определяли с помощью референс-системы «ХеликоБест-антитела», которая отличается принципом выявления антител, связавшихся с адсорбированным на твердой фазе антигеном. В соответствии с критериями, рекомендованными производителем, анализ экспериментальных данных позволил отнести 42,5% образцов свыоротки (34/80) к позитивным и 57,5% (46/80) – к негативным или сомнительным (Табл. 1). Сопоставление результатов, полученных с помощью двух тест-систем, показало, что предложенный в настоящей работе лабораторный вариант ИФА характеризуется высокой чувствительностью (94,1%) и специфичностью (93,5%).

Табл. 1

Сравнение результатов выявления антител против CagA в сыворотках с помощью двух вариантов ИФА

Непрямой ИФА



Pages:     | 1 || 3 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.