WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 | 2 ||

Создание иммунохимических реагентов для выявления caga-антигена helicobacter pylori и антител против него

-- [ Страница 3 ] --

Референс-ИФА

Позитивные

Негативные

Позитивные

32 (40.0%)

3 (3.8%)

Негативные

2 (2.5%)

43 (53.8%)

Иммунизация мышей и оценка иммунного ответа. Проведена серия иммунизаций 6 групп мышей препаратами рекомбинантных белков. Сравнение титров антител в сыворотках иммунизированных животных выявило, что уровень иммунного ответа животных, которым инъецировали rCagAfr.1 или rCagAfr.3 в ПААГ, был существенно выше, чем у мышей, иммунизированных этими белками в растворенной форме. Результаты иммунизации белком rCagAfr.2 в растворимой форме и в ПААГ не отличались. Эти данные, с одной стороны, свидетельствуют об адъювантном эффекте ПААГ и демонстрируют целесообразность его использования в дополнение к стандартным приемам иммунизации животных. С другой стороны, они служат экспериментальным подтверждением различий в иммуногенности антигенов rCagAfr.1-3, предсказанных с помощью методов биоинформатики.

Получение и характеристика МКАТ. Для создания гибридом-продуцентов МКАТ против rCagAfr.1, fr.2 и fr.3 проведено 3 независимых цикла слияния и отбора гибридов. Получено 36 гибридом-продуцентов антител к рекомбинантным фрагментам белка CagA, из которых по результатам тестирования надосадков и ростовым характеристикам отобраны 4 антителопродуцирующие культуры. В ходе отбора гибридом этим клонам присвоены коды 1H1, 1H11, 3H7 и 7E4, которые далее использованы как шифры МКАТ, синтезируемых этими культурами.

Исследование способности МКАТ реагировать с рекомбинантными фрагментами CagA методами ИФА и иммуноблоттинга (Рис. 5а, б) показало, что МКАТ 1H1 взаимодействует исключительно с фрагментом rCagAfr.1, МКАТ 1H11 распознает два рекомбинантных антигена - rCagAfr.2 и fr.4, а МКАТ 7E4 связывается с тремя фрагментами - rCagAfr.2, 3 и 4. Наконец, МКАТ 3H7 реагирует с белками rCagAfr.3 и 4.

Рис. 5. Исследование антигенной специфичности МКАТ методами иммуноблоттинга (А) и непрямого ИФА (Б). А – выявление рекомбинантных белков rCagAfr.1, fr.2, fr.3 и fr.4 (65, 44, 39 и 75 кДа, обозначены 1, 2, 3 и 4, соответственно) в лизатах E. coli. ЭФ - электрофореграмма разделения лизатов в 10% ПААГ. Указаны шифры МКАТ. Б – ИФА с очищенными рекомбинантными белками. Указаны средние значения оптической плотности (ОП450) по трем экспериментам.

Эти данные позволили определить взаимное расположение эпитопов, распознаваемых четырьмя МКАТ. При этом, поскольку созданные рекомбинантные белки rCagAfr.1-3 представляют полную последовательность цитотоксина CagA, аннотированную в GenBank под номером ACR15106, стало возможным картирование эпитопов МКАТ на полной молекуле CagA, начиная с N-конца (Рис. 6). МКАТ 7E4 выявляет белки rCagAfr.2, fr.3 и fr.4. Следовательно, детерминанта, распознаваемая этим антителом, расположена на участке аминокислотной последовательности CagA, общем для трех белков, то есть между Ser796 и Val876 белка CagA ACR15106. МКАТ 1H11 взаимодействует с рекомбинантными белками rCagAfr.2 и fr.4, однако не связывается с rCagAfr.1 и fr.3, что свидетельствует об отсутствии эпитопов этого МКАТ на последних двух белках. Таким образом, можно локализовать детерминанту, распознаваемую антителом 1H11, в интервале между Asp562 и Gln795. Аналогичным образом, эпитоп, распознаваемый МКАТ 3H7, расположен на участке Asn877-Tyr1114 белка CagA ACR15106, а антигенная детерминанта 1H1 локализована в N-терминальной области ACR15106, между Asp1 и Ser461. Таким образом, МКАТ 1H1, 1H11, 3H7 и 7E4 распознают 4 различные неперекрывающиеся линейные эпитопа на молекуле CagA, что подтверждается результатами иммуноблоттинга, непрямого ИФА, а также ингибиторного ИФА.

Рис. 6. Картирование эпитопов, распознаваемых МКАТ 1H1, 1H11, 7E4 и 3H7 на молекуле CagA ACR15106. Цифры по горизонтальной шкале – номера а.к.о. в последовательности ACR15106, начиная с N-конца.

Способность МКАТ реагировать с природным белком CagA H. pylori исследовали методом иммуноблоттинга, используя лизаты 17 клинических изолятов H. pylori. Антитела 1H1, 1H11 и 3H7 выявляют антиген с молекулярным весом 120-130 кДа в белковых фракциях 15-и из 17-и протестированных изолятов H. pylori (Рис. 7). Именно в диапазоне 120-140 кДа находится молекулярный вес цитотоксина CagA (Hatakeyama, Higashi, 2005), что позволяет утверждать, что МКАТ 1H1, 1H11 и 3H7 связываются с полноразмерным белком CagA. В то же время, названные реагенты не выявляют белок 120-130 кДа в пробах двух культур (№7 и №8), что свидетельствует, вероятно, об отсутствии гена cagA в геноме этих двух изолятов.

Для проверки этого предположения, было проведено молекулярно-генетическое типирование всех использованных культур H. pylori. Амплификация участка гена cagA и секвенирование ампликонов подтвердило, что 15 из 17 штаммов являются cagA-позитивными – они несут ген cagA, причем его «западную» форму в двух вариантах – АВС (Xia et al., 2009; размер ампликона 520 п.н., Рис. 7в) или ABCC (630 п.н.). В геноме двух изолятов (№7 и №8) ген cagA не обнаружен.





Анализ особенности молекулярной организации гена cagA клинических изолятов H. pylori выполнен в России впервые. Он свидетельствуют о том, что на территории Северо-Запада России преимущественно распространены «западные» штаммы H. pylori, а «восточноазиатские» штаммы H. pylori на данной территории представлены редко.

Рис 7. Выявление белка CagA (120-130 кДа) и гена cagA в 17 культурах H. pylori. A – электрофоретическое разделение белковых проб, уравненных по концентрации суммарного белка, в ПААГ. 1-17 – номера проб, К – контрольная культура E. coli, экспрессирующая rCagAfr.4 (75кДа). М- маркер молекулярных весов белков. Б - выявление белка CagA с помощью МКАТ 3H7 методом иммуноблоттинга. В - электрофоретическое разделение продуктов амплификации фрагментов гена cagA. К – контроль, плазмида pQE31-cagAfr.4. М – маркер молекулярных размеров ДНК.

Таким образом, выявление белка CagA с помощью МКАТ 1H1, 1H11 и 3H7 методом иммуноблоттинга оказывается специфичным и позволяет эффективно различать CagA-позитивные и CagA-негативные штаммы.

Разработка двухцентрового ИФА. При конструировании иммунометрической системы выявления белка CagA методом двухцентрового ИФА осуществлен подбор комплементарной пары МКАТ. В качестве реагента, иммобилизованного на твердой фазе и захватывающего антиген из раствора, выбрано антитело 1H11, которое характеризуется высокой эффективностью связывания растворенного антигена и сохраняет активность при прямой адсорбции на твердой фазе. МКАТ 3H7, конъюгированное с пероксидазой, выбрано в качестве выявляющего реагента, поскольку оно сохраняет специфичность связывания антигена после конъюгирования с ферментной меткой и распознает антигенную детерминанту, пространственно удаленную от эпитопа 1H11. Моделирование иммуноферментной системы выполнено с использованием очищенного белка rCagAfr.4, который включает центральную и C-концевую области цитотоксина и несет одновременно эпитопы, распознаваемые МКАТ 3H7 и 1H11. Полученный результат показал, что с помощью выбранных реагентов возможно выявление антигена в широком диапазоне концентраций. Нижним порогом чувствительности разработанного варианта ИФА является концентрация антигена около 1 нг/мл.

С помощью двухцентрового ИФА проведено выявление белка CagA в пробах 17 изолятов H. pylori, уравненных по общему содержанию белка. Уровень сигнала в пробах cagA-позитивных культур (среднее значение оптической плотности ± стандартная ошибка 0,85±0,06) был достоверно выше, чем уровень, определяемый в пробах cagA-негативных изолятов H. pylori (0,04±0,01; p<0,01).

Заключение. Таким образом, использование технологии создания рекомбинантных белков позволило преодолеть проблему получения стандартизированных препаратов антигена CagA высокой чистоты. За счет создания панели рекомбинантных фрагментов CagA стало возможным выявление сывороточных анти-CagA антител, изучение иммунологических свойств различных участков цитотоксина, а также картирование эпитопов, распознаваемых МКАТ на молекуле CagA. Изолирование высоко- и низкоиммуногенных участков последовательности цитотоксина, а также использование приемов стимуляции иммунного ответа мышей, позволило получить МКАТ, реагирующие как с иммунодоминантными, так и с низкоиммуногенными эпитопами CagA. Показано, что созданные МКАТ распознают нативный белок CagA H. pylori в различных вариантах иммуноанализа. С использованием полученных МКАТ создана первая система двухцентрового ИФА для выявления CagA, основанная на использовании исключительно моноклональных антител.

  1. ВЫВОДЫ
  1. На основании in silico анализа в молекуле цитотоксина CagA выделено три качественно различные области, из которых N-концевая высоко консервативна и низкоиммуногенна, центральная - консервативна и обладает высокой иммуногенностью, а C-концевая характеризуется высокой вариабельностью и низкой иммуногенностью.
  2. Сконструированы четыре штамма Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантные фрагменты белка CagA. Фрагменты воспроизводят структуру высоко- и низко-иммуногенных областей молекулы CagA и в совокупности представляют всю аминокислотную последовательность белка.
  3. Рекомбинантные фрагменты CagA позволяют выявлять сывороточные антитела против цитотоксина, исследовать их изотипический состав и специфичность в отношении различных участков молекулы белка CagA.
  4. Впервые созданы штаммы гибридом-продуцентов моноклональных антител против высоко- и против низкоиммуногенных участков молекулы CagA.
  5. Моноклональные антитела распознают четыре изолированных линейных эпитопа и реагируют как с рекомбинантными полипептидами, так и с нативным белком CagA H. pylori.
  6. Моноклональные антитела (1H1, 1H11 и 3H7) позволяют дифференцировать CagA-позитивные и CagA-негативные штаммы H. pylori методом иммуноблоттинга. Антитела 1H11 и 3H7 составляют комплементарную пару для определения белка CagA методом двухцентрового иммуноферментного анализа.
  1. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

  1. Климович А.В., Самойлович М.П., Суворов А.Н. Создание и характеристика рекомбинантных фрагментов белка CagA Helicobacter pylori // ЖМЭИ. 2010. В. 2. С. 74-79.
  2. Климович А.В., Грязева И.В., Самойлович М.П., Терехина Л.А., Крутецкая И.Ю., Климович В.Б. Создание и характеристика моноклональных антител против белка CagA Helicobacter pylori // ЖМЭИ. 2010. В. 3. С. 62-67.
  3. Klimovich A.V., Samoylovich M.P., Gryazeva I.V., Terekhina L.A., Suvorov A.N., Klimovich V.B. Development of Immunoreagents for Diagnostics of CagA-Positive Helicobacter pylori Infections // Helicobacter. 2010. V. 15. P. 193-200.

Тезисы:

  1. Самойлович М.П., Климович А.В., Терехина Л.А., Грязева И.В., Климович В.Б. Создание моноклональных антител для выявления белка CagA Helicobacter pylori // Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. В. 2(22). Материалы конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург. 2008. С. 192-193.
  2. Климович А.В., Терехина Л.А., Грязева И.В., Самойлович М.П., Климович В.Б. Моноклональные антитела против рекомбинантных фрагментов белка CagA Helicobacter pylori // Материалы конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Санкт-Петербург. 2008. С. 126.
  3. Терехина Л.А., Грязева И.В., Климович А.В., Самойлович М.П., Климович В.Б. Моноклональные антитела для диагностики CagA-позитивных штаммов против Helicobacter pylori // Материалы научной конференции «От лучей Рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института». Санкт-Петербург. 2008. С. 318–319.
  4. Klimovich A.V., Terekhina L.A., Gryazeva I.V., Samoylovich M.P., Suvorov A.N., Klimovich V.B. Development of Recombinant Helicobacter pylori CagA protein fragments for antibody production and characterization // Clinical Microbiology and Infection. 2009. V. 15 (s4). P1162. Abstracts of the European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Helsinki, Finland, 2009).


Pages:     | 1 | 2 ||
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.