WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 17 |

Исследованияаутоантител к ферментамантиоксидантной системы ипуринового метаболизма убольныхревматоиднымартритом

-- [ Страница 2 ] --

Диссертационноеисследование было поддержано грантом Регионального общественного фондасодействия отечественной медицине (2005г.) игосударственным научным грантом Волгоградскойобласти (2008 г.). Результаты проведенныхисследованийвошли в работу «Иммобилизированныесистемы биологически активных веществ в диагностикеи лечении ревматических заболеваний»,получившей Iпремию Волгоградской области в сференауки и техники в номинации «За достиженияв разработкеи практическом применении новых методов исредств в здравоохранении» (2006 г.).

Результаты диссертациибыли апробированы на совместном заседанииУченогоСовета НИИ клинической иэкспериментальной ревматологии РАМН икафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО«Волгоградский государственныймедицинский университет» 1 июня 2009 года (Протокол №4).

ВНЕДРЕНИЕ ВПРАКТИКУ

Методы определенияАт к ферментам АОС и ПМ убольных РЗиммуноферментным методом с помощьюиммобилизированныхантигенных препаратоввнедрены впрактику работы муниципального учрежденияздравоохранения «Городская клиническая больница № 25»г. Волгограда, государственного учрежденияздравоохранения «Волгоградский областнойклинический госпиталь ветеранов войн»,муниципального учрежденияздравоохранения «Городская больница №1 им. С.З.Фишера»г. Волжского. Материалыпроведенного исследования входят влекционный курс на кафедре госпитальной терапииВолгоградского государственногомедицинского университета, а также используются насеминарах, научно-практических иклинических конференциях врачей.

ОБЬЕМ ИСТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложенана 330 страницах машинописноготекста и состоит из введения, 11 глав, обсуждениярезультатов, выводов и практическихрекомендаций. Диссертация иллюстрирована 54 таблицами, 44 рисунками, 5 выписками изистории болезни. Указатель литературы содержит376 источников, в том числе 72 отечественных и 304иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Среди иммунологическихметодов диагностики антител вревматологии наибольшее распространение получилииммуноферментный (ИФА) ииммунофлуоресцентный (ИФЛ) методы анализа.Опираясь на данные, полученные в ходе нашихраннихисследований о том, что классическиеварианты ИФА и ИФЛ не позволяют в должной мере оценитьпроцессы антителогенеза к ферментам АОС иПМ у больных РА, нами предварительнобыл проведен сравнительныйанализ ИФА и ИФЛ на основе ИГАП сиспользованием иммобилизированныхферментов в качестве антигенной матрицы.Была продемонстрированакорреляция высокой силы между двумяспособами определения антител (r=0,764; p<0,001). Однако 6,7% образцов вконтрольной группе(здоровыелица) были отнесены кпозитивным при использовании ИФЛ, а 4,2% образцов сыворотки кровибольных РА, которые были положительными вИФА, оказались отрицательными при проведениииммунофлуоресцентного анализа.

Учитываяоднонаправленность выявленныхзакономерностей, а также техническую оснащенностькаждой конкретной лаборатории, можнорекомендовать для применения оба метода,отдавая предпочтение, тем не менее,иммуноферментной методике как болеечувствительной. Принимая во вниманиебльшуютрудоемкость ИФЛ, в качестве предпочтительнойметодики нами был выбран методИФА.

На следующем этапедля выборапредпочтительного вариантаиммуноферментного методаопределения Ат к ферментам был проведен сравнительный анализметодики ИФА, основанной на использованиимикротитрационных планшетов (классический вариант ELISA-теста), и варианта ИФА с использованиемиммобилизированныхгранулированныхантигенныхпрепаратов (ИГАП).

При постановкеиммуноферментного анализа сиспользованием ИГАП наблюдалось как повышениеаффинности, связанное с разделением фаз иповышением локальной эффективной концентрациисвязывающих участков антигена на разделе фаз, так исущественное увеличение концентрацииантигена при уменьшении объема реагентов. Кроме того,помещение гранул с магнитными свойствами впеременное магнитное поле вызывает перемещение фаздруг относительно друга, в результате чеговероятностьвстречи антигенраспознающего центраантител, находящихся в жидкой фазе, с антигеном,фиксированном на твердой фазе, повышается.Также этим достигается перемешивание компонентовсистемы, предотвращающее неравномерностьраспределения компонентов в растворе.Таким образом, реакция антиген – антителосмещается в направленииобразования комплекса.

Таким образом, учитывая, что модифицированнаяметодика иммуноферментного анализа сиспользованием ИГАП имеет очевидные преимуществаперед методиками, использующими в качестветвердой фазы полистироловый планшет, припроведенииисследований, направленных на изучениепроцессов антителогенеза к ферментам АОСи ПМ, предпочтение было отдано ИФА симмобилизированными антигенными препаратами.

В качестве антигеновиспользовались коммерческие препаратыисследуемых ферментов производства фирмы «Sigma» (США):препарат супероксиддисмутазы изэритроцитов человека (Superoxide Dismutase from human erythrocytes; Cat. №S 9636); препарат глутатионредуктазы(GlutathioneReductase from Bakers yeast; Cat. № G 3664); препарат каталазы из эритроцитов человека (Catalase from human erythrocytes; Cat. № C 3556); препарат аденозиндезаминазыиз печени быка (Adenosine Deaminase from bovine spleen, Cat. № А 5043); препарат 5'-нуклеотидазыиз яда гремучей змеи (5'-Nuc­leotidase from Crotalus atrox venom; Cat. № N 5880); препарат пуриннуклеозидфосфорилазы изкрови человека (Nucleoside Phosphorylase from human blood; Cat. № N 3514); препарат гуаниндезаминазыиз печени кролика (Guanase from rabbit liver; Cat. № G5752); препарат ксантиноксидазы микробногопроисхождения (Cat. № Х 2252). Также был использованкоммерческий препарат "Церулоплазминдиагностический очищенный жидкийчеловеческий" серия 1 К 118 (Предприятие попроизводству бакпрепаратов НИИэпидемиологии и микробиологии им. Пастера,Санкт-Петербург, Россия).





Для полученияиммобилизированных форм изучаемыхферментов использовали растворы с соответствующейконцентрацией: для СОД – 1,4 мг/мл, для ГР– 1,6 мг/мл,для ЦП – 0,75ммоль/л, для КАТ – 1,4 мг/мл, для АДА – 100 мкг/мл, для 5'-НТ– 100 мкг/мл;для ПНФ – 50мкг/мл; для ГДА – 20 мкг/мл, для КО – 50 мкг/мл.

Учитывая достаточнуюотносительную молекулярную массуиспользуемых в исследовании ферментов (ГР – 50-55 кДа, ЦП – 132 кДа, КАТ – 240 кДа, АДА – 36 кДа, 5'-НТ – 60-120 кДа; ПНФ– 90-92 кДа;ГДА – 100-120кДА; КО – 300кДа), иммобилизацию проводили методомэмульсионной полимеризации в модификацииИ.П.Гонтаря с соавт. (1999 г.) в потоке газообразногоазота с включением в структуру гранулмагнитного материала. Беря во вниманиенебольшую относительную молекулярнуюмассу эритроцитарной СОД ( 30 кДа)иммобилизацию фермента проводили путемпришивки его молекулы глютаровымальдегидом к инертной полиакриламиднойгрануле, содержащей магнитный материал.Иммобилизацию осуществляли по методу,описанному A.С.Johansson et all.(1974). Было определено, что максимальнаясорбция СОД на гранулы, активированные глютаровымальдегидом, составила 980 мкг белка на 1 мл (70%). Позавершению полимеризации гранулы с иммобилизированнымферментом втечение 15-20 мин отмывали ацетоном ифизиологическим раствором с детергентом (0,05% твин-20) от не прореагировавших мономеров,эмульгатора и гексана.

В итоге были полученыИГАП,представляющие собой двойныеполиакриламидные гранулы правильной сферическойформы с размером частиц от 10 до 100 мкм.Средний диаметр гранул составил 55±6,8 мкм(соотношениеполимерный носитель : железо 2:1, в пересчете на сухую массу).ИГАП имелидлительный срок хранения (до 2-х лет);после регенерации они были пригодны дляповторного использования.

Дляопределенияпоказателя индекса авидности (ИА) изучаемых антител также былприменениммуноферментный анализ. В качестведенатурирующего вещества использовали 8Мраствор мочевины. Выявление в испытуемойсыворотке антител с индексом авидностиниже 30% расценивалось как низкий уровеньавидности. Показатель авидности, равный илипревышающий 50%, свидетельствует о наличии всывороткевысокоавидных антител. Показательавидности антител в интервале 31-49%расценивался как неопределенный.

С диагностическойцелью, а также для оценки корреляции сизучаемыми показателями был проведен целый рядиммунологических проб, позволяющихохарактеризовать иммунный статус больных РА.Методом радиальной иммунодиффузии в гелепо Манчини определяли различные классыиммуноглобулинов (A, G, M). Ревматоидный фактор выявляли с помощьютеста латекс агглютинации. Циркулирующиеиммунные комплексы определяли методомпреципитации с полиэтиленгликолем 6000 по Haskovaв модификации Б.А.Лемперта. Определениеантинуклеарного фактора по Кунсупроводилосьметодом непрямой иммунофлуоресценции сиспользованием в качестве субстратакриостатных срезов печени белой крысы вкачественном варианте с выделением типа иинтенсивности свечения.

Активность изучаемыхферментов определялась в сывороткекрови:эритроцитарной СОД пометоду Чевари С. и соавт. (1985), плазменнойСОД пометоду Дубининой Е.Е. и соавт.(1986).; глутатионредуктазы по методу Ченас Н.К. (1989);каталазы пометоду Коробейниковой Э.Н.(1989); церулоплазмина пометоду RavinH.A. вмодификацииТена Э.В. (1981); аденозиндезаминазыпо методуMartinek R.G.(1963); 5-нуклеотидазыпо методике Wood R. и Williams D. (1981); пуриннуклеозидфосфорилазыпо методике Robertson B.C. иHoffe P.A.(1973); гуаниндезаминазы по методике Caraway W.T. с использованиемцветной реакции Бертелота (1966);ксантиноксидазы (О-форма) по методике KalckarH.M. вмодификацииДячиной Е.Г. (1973) иксантиндегидрогеназы (D-форма) по методу Devenyi Z.J. etall. (1987).

Статистический анализэкспериментальных данных выполнялся спомощью программныхпакетов«STATISTICA 6.0FOR WINDOWS» (StatSoft Inc., USA) иSPSS (SPSS for Windows, Release 12.0, SPSS Inc.,Chicago, IL, USA), а также пооригинальным программам с использованием формул,приведенных в соответствующих руководствах.Представление описательных статистик ивыбор статистических критериевпроизводились исходя из цели исследования,решаемых при этом задач и рекомендацийруководствпо биостатистике.

На основе моделиприближенных отношений и методов вывода попрецедентамсовместно с сотрудниками кафедрыПрограммного обеспеченияавтоматизированных систем ВолгоградскогоГосударственного ТехническогоУниверситета (кандидат технических наук,доцент О.А. Сычев; доктор технических наук,профессор А.М. Дворянкин) был разработанпрограммно-информационный комплексподдержки диагностики ревматическихзаболеваний. Комплекс прошел опытнуюэксплуатацию в НИИ Клинической иЭкспериментальной Ревматологии РАМН в2005-2008 гг. Эффективность комплекса изучалась придиагностике формы, активности и теченияревматоидного артрита по даннымлабораторных исследований (16 типовсимптомов). Обучающую выборку составили 78 больныхревматоидным артритом с диагнозом,подтвержденным в течение длительноговремени, контрольную выборку – 25человек.

КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ

Под наблюдениемнаходились178 больныхРА, 48 больныхОА и 30практическиздоровых людей. В группусравнения также были включены 100 пациентов ссуставнымсиндромом как проявлениемпсориатического, подагрического,реактивного артритов, болезни Бехтерева, атакже артритов при системной краснойволчанке. Диагнозы данных заболеваний вовсех случаях устанавливались на основаниидиагностических критериев, разработанных ведущимиревматологическими ассоциациями.

Больные ревматоиднымартритом

Диагностика РАосуществлялась в ходе всестороннегоклинического обследования припоступлении больных на стационарноелечение с использованием диагностических критериевАмериканской ревматологическойассоциации (АРА) и уточнялась в процесселечения. Под наблюдениемнаходились 178 больных РА, из которых 126 (70,8%) женщин и52 (29,2%)мужчин. Средний возраст больных – 48,9 ± 13,2 года. Инвалидность поосновному заболеванию (РА) установлена у68 (38,2%)больных. Социальный состав больных даннойгруппы: рабочие – 64(36%) человек, служащие – 76(42,7%), учащиеся 14 (7,9%),частные предприниматели 14 (7,9%) и домохозяйки– 10 (5,6%)человек. Попродолжительности заболевания больныераспределились следующим образом: до 5 лет – 10 (5,62%), 6-10 лет – 88 (49,43%), 11-15 лет– 64 (35,96%), 16-20 лет– 12 (6,74%), свыше 20 лет– 4 (2,25%) человека.Средняя продолжительность РА составила 11,14 ± 2,33 года.

Критерии включениябольных РА в исследование:возраст 18лет (включительно) и старше;наличие информированногосогласия; наличие у больного РА,соответствующего критериям Американской РевматологическойАссоциации;срок,прошедшийпосле установления диагноза, – не менее 6месяцев.

Критерии исключения изисследования: беременность или лактация; алкогольная и(или)наркотическая зависимость;инфицирование вирусомиммунодефицита человека или возбудителями вирусныхгепатитов В и С; наличие злокачественного новообразования любойлокализации на момент отбора; тяжелые,декомпенсированные или нестабильныесоматические заболевания исостояния (сахарный диабет 1или 2 типа, хроническая сердечнаянедостаточность 3, 4 функциональногокласса, хроническая почечная недостаточность втерминальной стадии, дыхательнаянедостаточность 2, 3 степени), требующиеактивного лечения.

I (минимальная) степеньактивности РА выявлена у 34 (19,1%), II(умеренная) – у 128 (71,9%) и III (максимальная) – у 16 (9%) больных.Наиболее многочисленной была категориябольных РА в возрасте 31-50 лет (75,28%) (см. таблицу1).

Таблица 1

Соотношение возрастабольных и активности патологическогопроцесса при РА

Степень активности Возраст (в годах)
До 20 21-30 31-40 41-50 Свыше50
I (n=34) 2 (5,88%) 12(35,29%) 14(41,18%) 6(17,65%)
II(n=128) 6 (4,68%) 10(7,81%) 34(26,56%) 60(46,88%) 18(14,06%)
III(n=16) 2 (12,5%) 8(50,00%) 6(37,50%)
Всего(n=178) 6 (3,37%) 14(7,87%) 54(30,33%) 80(44,94%) 24(13,48%)


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 17 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.