WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

Гепатопротекторные свойства флавоноидов (фармакодинамика и перспективы клинического изучения)

-- [ Страница 2 ] --

6. Исследуемые флавоноиды в норме и при эндотелиальной дисфункции увеличивают продукцию NO, вероятно, путем активации eNOS, и повышают печеночный кровоток, а также ограничивают гиперпродукцию NO iNOS в печени, стимулированную СС14, что в определенной степени обусловливает гепатопротективные свойства флавоноидов.

7. СЭ в дозе 300 мг/кг при лечебном применении на модели хронического СС14-гепатита уменьшает развитие фиброза, а также улучшает желчеобразовательную функцию печени в норме и при патологии печени.

8. Высокая эффективность СЭ, связанная с воздействием на основные звенья патогенеза острых и хронических поражений печени, наличие у него более выраженного лечебного действия, чем у карсила, позволяет рекомендовать СЭ в качестве субстанции для создания нового гепатопротекторного препарата.

Публикации.По теме диссертации опубликовано 42 печатных работы из них 9 статей в научных журналах, которые входят в перечень рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 351 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований (8 глав), заключения, общих выводов, списка литературы, приложений А, Б и В (55 страниц). Работа иллюстрирована 31 таблицей и 89 рисунками. Библиографический список включает 649 источников, из которых 416 публикации иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования служили индивидуальные флавоноиды: кверцетин (фирмы Merk), диосмин, гесперидин, выделенные из растительного сырья (Vicia tanuifolia (variabilis) Roth. и кожуры цитрусовых), сумма, содержащая арабиноглюкозид - и ксилоглюкозид диосметина, которая условно названа флавицином и СЭ, полученные из надземной части горошка обрубленного – Vicia abbreviate Fish. ex Spreng.(Vicia truncatula Fich. ex Bieb.), сем. бобовых – Fabaceae на кафедре органической химии ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава» под руководством доктора фармацевтических наук, профессора Э.Т. Оганесяна. С помощью физико-химических методов анализа: температуры плавления, УФ-, ИК- и ПМР- спектроскопии, тонкослойной (ТСХ) и бумажной (БХ) хроматографии, пробы смешения, подтверждено строение выделенных веществ [Хочава М.Р., 2001, Шаренко О.М., 2005]. СЭ представляет собой порошок темно-коричневого цвета с прият­ным специфическим запахом, содержащий 5,12 – 5,67% флавицина [Шаренко О.М., 2005]. Для стандартизации предложен метод количественного спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в сухом извлечении при 410 нм, ошибка которого находится в пределах 3,09-3,55%. В качестве препарата сравнения использовали карсил.

Опыты проведены на 1050 белых беспородных и линии Wistar половозрелых крысах обоего пола массой 170-240 г. (по 10-12 животных контрольных групп и 6-8 опытных групп) и 80 белых мышах обоего пола массой 25-30 г. (по 10 мышей в группе). Животные содержались в условиях вивария Пят ГФА, Волгоградского государственного медицинского университета и государственного учреждения «Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздрава РФ» г. Москва с естественным световым режимом на стандартной диете [ГОСТ Р 50258-92], с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях»[2007] и правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ [ГОСТ Р 51000.3-96, ГОСТ Р 51000.4-96]. Забой животных проводился согласно требований «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [2007].

Определение эффективной дозы проведено на модели острого CCl4 –гепатитогепатоза, который воспроизводили путём введения per os с помощью зонда 3 раза через день 50% раствора CCl4 в вазелиновом масле в дозе 0,15 мл/100 г массы тела животного. Гесперидин, диосмин, флавицин, кверцетин исследовали в диапазоне доз 25, 50, 100 и 200 мг/кг, СЭ - 100, 200, 300 и 500 мг/кг при пероральном введении в виде водной суспензии по лечебно-профилактической схеме: в течение 7 дней до CCl4, а затем на фоне воспроизведения модели (5 дней). Исследуемые флавоноиды и СЭ вводили ежедневно в одно и то же время до кормления животных за 1 час до введения гепатотоксина. Установленные эффективные дозы были выбраны для дальнейших исследований и составили для индивидуальных веществ -100 мг/кг (менее 1/60 от LD50), для СЭ – 300 мг/кг (менее 1/20 от LD50). Карсил изучали в дозе 100мг/кг.

Острое поражение печени этанолом воспроизводили курсовой алкоголизацией крыс-самок путём 2-х кратной внутрибрюшинной инъекции 33% раствора этанола в сутки в дозе 0,75 мл/100г массы тела животного в течение 7 дней [Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф.,2002]. Исследуемые флавоноиды, СЭ и карсил животным вводили в эффективных дозах за 5 дней до введения этанола, а затем совместно с ним (7 дней).

Курсовое поение здоровых животных флавоноидами, СЭ и карсилом осуществляли в течение 12 дней в эффективных гепатопротекторных дозах.

Хроническую алкоголизацию проводили путем перорального введения 40% этилового спирта в дозе 14 мл/кг [Мансурова И.Д., 1985] в течение 60 дней. Лечебное действие СЭ изучали в дозе 300 мг/кг в сравнении с карсилом в дозе 100 мг/кг. Через сутки после 60-дневной алкоголизации (исходный контроль), через 7, 14 и 21 день лечебного применения СЭ и карсила проводили забой животных опытных и соответствующих контрольных групп. Контролем служили животные, которые продолжали получать только 40% этанол в дозе 14 мл/кг также 7, 14 и 21 день.





Оценку эффективности гепатозащитного действия проводили по степени нормализации биохимических показателей основных патологических синдромов, наблюдающихся при поражениях печени: цитолиза - активности в сыворотке АлАт, АсАт, КФ, ФЛА2, ГДГ, соотношению АсАт/АлАт; холестаза - активности в сыворотке крови ЩФ, -ГТП, содержанию билирубина и его фракций (прямого и непрямого билирубина), мезенхимального воспаления - определение белковых фракций, соотношения альбумины/глобулины и тимоловой пробы в сыворотке крови; печеночно-клеточной недостаточности, характеризуя состояние белково-синтетической и метаболической функций печени по показателям белкового (содержание общего белка, альбуминовой фракции и активности ХЭ, содержанию мочевины в сыворотке крови), углеводного (содержание глюкозы в крови и гликогена в печени) и липидного (содержание холестерина, ТРГ в сыворотке крови, содержание ТРГ и ФЛ в печени) обменов. В качестве маркеров хронизации патологического процесса в печени определяли компоненты соединительной ткани: содержание в печени общего оксипролина (ОП) и содержание гликозаминогликанов (ГАГ) в сыворотке крови. Кроме этого, изучали гистоморфологическую картину органа при окраске препаратов гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления компонентов соединительной ткани и суданом III для выявления липидов. Микрофотосъемку гистологических препаратов производили на микроскопе MICROS AUSTRIA (Австрия) цифровой фотокамерой «Olympus» (Япония). Об эффективности гепатозащитного действия судили также по гибели животных контрольных групп и животных, получавших гепатопротекторы.

Для сравнения эффективности гепатозащитного действия исследуемых флавоноидов, СЭ и карсила рассчитывали процент гепатопротекции по изученным биохимическим показателям в отдельности и в целом с учетом всех показателей по формуле: х 100%, где Н – коэффициент гепатопротекции, О – значение показателя в опытных группах, получавших совместно СС14 и гепатопротекторы, К – значение показателя у животных, получавших только СС14 (патологический контроль), N – значение показателя у интактных животных (нормальный контроль).Чем больше величина данного критерия приближалась к 100 %, тем более эффективным считалось гепатозащитное действие.

Интенсивность ПОЛ изучали по содержанию ТБК-активных продуктов в печени и сыворотке крови, диеновых конъюгатов (ДК) в печени, интенсивности спонтанного и Fe2+-аскорбатиндуцированного ПОЛ в постъядерной фракции печени (ПФП). Оценку антиоксидантной системы (АОС) проводили путём определения активности в ПФП каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), глутатион-S-трансферазы (Г-S-Т), глутатионредуктазы (ГР), глутатионпероксидазы (ГП): общей, Se-зависимой и Se-независимой, НАДФ+-редуктазы при использовании в качестве субстратов малата (МДГ), глюкозо-6-фосфата (Г-6-ФДГ) и изоцитрата (ИЦДГ), содержанию глутатиона восстановленного (GSH) в печени, по общей антиокислительной активности (АОА) сыворотки крови и резистентности эритроцитов к спонтанному гемолизу. Для количественной оценки дисбаланса в системе ПОЛ/АОС рассчитывали коэффициент окислительного стресса как отношение произведения показателей ПОЛ к произведению показателей АОС, выраженных в относительных единицах к норме [Давыдов Б.В., 1991], принимая, что при сохранении баланса в системе ПОЛ/АОС коэффициент (К) = 1.

Состояние энергообмена изучали по содержанию глюкозы, гликогена, пирувата, лактата, АТФ в печени и активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ), цитохром-с-оксидазы (ЦТО) и Mg 2+ -АТФ-азы в митохондриальной фракции печени. Антитоксическую функцию печени оценивали, измеряя активности ферментов метаболической трансформации ксенобиотиков - НАДН:K3[Fe(CN)6]-редуктазы, НАДФН: неотетразолий (НТ) – редуктазы, N-деметилазы, n-гидроксилазы в микросомальной фракции печени.

Изучение антиоксидантного действия гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина in vitro проведено на модели Fe2+индуцированного ПОЛ в липосомальной системе, полученной на основе фосфатидилхолина.

Изучение влияния флавоноидов на содержание радикалов NO в печени и в организме в целом проводили методом ЭПР при использовании Fe3+ДЭТК2 и Fe3+МГД2 в качестве ловушек в норме и после индукции ПОЛ CCl4.

Изучение влияния гесперидина и флавицина на печеночный кровоток проведено в норме при их пероральном введении в дозе 100 мг/кг и в условиях стимуляции ацетилхолином (0,01 мг/кг) и блокады нитро-L-аргинином (10 мг/кг) синтеза эндогенного оксида азота при введении анализаторов и флавоноидов (30 мг/кг) в левую бедренную вену.

Эндотелийпротективное действие гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина изучено в условиях моделирования дисфункции эндотелия в результате экстирпации матки с придатками у крыс-самок, вызывающей недостаточность половых гормонов. Исследуемые вещества вводили перорально в течение 4-хнедель после кастрации в дозе 100 мг/кг. Препаратом сравнения служил сулодексид с доказанной эндотелиопротективной активностью в дозе 30 ЕВЛ/кг (единицы высвобождения липопротеидлипазы). О влиянии флавоноидов на эндотелиальную дисфункцию судили по реакции сосудов на введение ацетилхолина (0,01 мг/кг), L-аргинина (100 мг/кг), нитро- L-аргинина (10 мг/кг) и нитроглицерина (0,007 мг/кг), и определяли скорость формирования тромба в сосудах по времени тромбообразования, вызванного аппликацией на стенку общей сонной артерии 50% раствора хлорида железа (III).

Измерение кровотока осуществлялось на предварительно наркотизированных этаминал-натрием (40 мг/кг) крысах с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 (рабочая частота 25МГц) и компьютерной программой ММ-Д-КMinimax Doppler v.1.7. (Санкт-Петербург, Россия).

Определение вязкости крови, агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ (5 мкМ) и индекс агрегации эритроцитов проводили с использованием реологических методов с применением регистрирующей аппаратуры: анализатор крови реологический (АРп-01, Россия), двухканальный лазерный анализатор агрегации (НПФ «Биола» LA-230-2, Россия), лазерный коагулометр («Минилаб-701», Россия).

Антифибротическое действие СЭ исследовали на модели хронического поражения печени СС14 (пероральное введение 50% масляного раствора СС14 9 раз, дважды в неделю в дозе 2,0 мл/кг массы тела) при его лечебном применении в дозе 300 мг/кг в сравнении с карсилом в дозе 100 мг/кг по измерению биохимических маркеров соединительной ткани (ОП и ГАГ) и обнаружению ее элементов на гистологических препаратах печени через 7, 14 и 21 день лечения. Отдаленные результаты лечения были изучены через 2 месяца после 21-дневного курса лечения.

Для оценки желчеобразовательной функции печени СЭ вводили в дозе 300 мг/кг 12 дней здоровым животным, а также на фоне острого поражения печени СС14: 50% масляный раствор СС14 вводили подкожно в дозе 0,4 мл/100 г массы тела, 1 раз в сутки, 4 дня. Определяли объем и состав (содержание желчных кислот – ЖК и холестерина) выделенной желчи с расчетом холато-холестеринового коэффициента.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью параметрического критерия t Стьюдента с определением средней арифметической (М) и ее стандартной ошибки (m), непараметрического критерия Манна-Уитни и коэффициента линейной корреляции.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Сравнительное изучение эффективности гепатозащитного действия флавоноидов, СЭ из V. abbreviate (truncatula) и их влияния на развитие окислительного стресса в условиях острого поражения печени тетрахлорметаном

Тетрахлорметан является наиболее известным гепатотоксином, применяемым для моделирования заболеваний печени. Он подвергается микросомальному окислению при участии цитохрома Р450 с образованием электрофильных алкилирующих интермедиатов и свободных радикалов, способных индуцировать ПОЛ и модифицировать биомолекулы в результате ковалентного связывания с ними. Как установлено в наших исследованиях, в результате введения СС14 наблюдался сдвиг про-антиоксидантного равновесия в сторону усиления ПОЛ (повышение содержания ТБК-продуктов и ДК, интенсивности Fe2+-аскорбатиндуцированного ПОЛ ПФП) с истощением АОЗ (падение активностей СОД, каталазы, ГП, Г-S-Т, НАДФ+-редуктаз, содержания GSH, АОА сыворотки крови), развитие гипоксического состояния с усилением анаэробного гликолиза и нарушением аэробной продукции энергии на уровне митохондрий (повышение соотношения лактат/пируват, снижение содержания глюкозы и гликогена в печени, снижение активности СДГ, ЦТО и повышение Мg2+-АТФазы), угнетение реакций микросомального окисления (снижение активностей N –деметилазы, n-гидроксилазы, НАДФН – НТ-редуктазы). Это сопровождалось развитием тяжелого поражения печени с проявлениями синдромов цитолиза (повышение активности ФЛА2, КФ, АлАт, АсАт и соотношения АсАт/АлАт), холестаза (повышение активности ЩФ, -ГТП, содержания общего билирубина, особенно фракции прямого билирубина), мезенхимального воспаления (диспротеинемия с увеличением глобулиновой фракции белков сыворотки крови и повышение тимоловой пробы), жировой дистрофии (увеличение количества ТРГ при снижении ФЛ в печени) и печеночно-клеточной недостаточности (уменьшение общего белка и особенно альбуминов в крови, снижение активности ХЭ, повышение фракции прямого билирубина в крови и содержания мочевины). На гистоморфологической картине также обнаруживались изменения, характерные для поражения печени ССl4: жировая и белковая дистрофия, очаги некроза, локализованные преимущественно в центральной зоне печеночной дольки, признаки воспалительной реакции (инфильтрация мононуклеарами), нарушения кровообращения в микрососудах (агрегация эритроцитов, стазы крови), поражения эндотелия синусоидов. На основании полученных данных можно говорить, что при введении крысам тетрахлорметана в печени развивался острый токсический активный гепатит с очаговой жировой дистрофией гепатоцитов (гепатитогепатоз). Количество погибших животных в этой группе составило 62,5%.

Лечебно-профилактическое применение флавоноидов, СЭ и карсила в эффективных дозах на фоне острого CCl4-гепатитогепатоза в разной степени влияло на восстановление биохимических показателей основных патологических синдромов поражения печени СС14, что отражает таблица 1, в которой знаком «+» обозначена полная нормализация показателя, отнесенного к тому или иному синдрому, «±» - неполная нормализация и «-» - отсутствие эффекта (показатель достоверно не отличается от такового у животных с патологией), а также указаны средние проценты гепатопротекции по синдромам. Видно, что в отношении устранения синдрома цитолиза флавицин, кверцетин и карсил проявили более выраженное действие, чем гесперидин и диосмин. Но флавицин, диосмин и гесперидин превосходили кверцетин и карсил по влиянию на развитие холестаза. Активацию мезенхимы кверцетин и карсил предупреждали более эффективно, чем флавицин, диосмин и гесперидин. Но флавицин и диосмин превышали действие кверцетина, гесперидина и карсила по влиянию на развитие синдрома печеночно-клеточной недостаточности. СЭ практически полностью нормализовал все изученные показатели.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.