WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

Конденсированные производные бензимидазола – новый класс антитромбогенных средств

-- [ Страница 2 ] --

Моделирование и степень внутрисосудистой агрегации тромбоцитов проводили и оценивали по методу, описанному J. F. Pinon (1984). Для оценки влияния соединений на внутрисосудистую агрегацию кровяных пластинок, вещества вводили перорально в дозе 50 мг/кг за 1,5 часа до наркоза животных. Индуктор агрегации АДФ вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг.

Исследования на моделях артериальных тромбозов, индуцированных аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) и воздействием анодного электрического тока на сонную артерию крыс осуществляли на наркотизированных нембуталом (50 мг/кг) животных спустя 2 часа после перорального введения препаратов согласно методу Kurz (1990) и Guglielmi G. et al (1991) соответственно. В качестве препаратов сравнения использовалась АСК, гликлазид и мексидол. Производные бензимидазола исследовались в изоэквимоляльных дозах АСК (20мг/кг). Для исследования влияния соединений на время образования тромба использовали ультразвуковой компьютеризированный аппарат «Минимакс-Доплер–К» (Санкт-Петербург) [Спасов, 2011].

Модель генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза на мышах была воспроизведена в соответствии с методикой [Di Minno, 1983]. В качестве тромботического агента использовали смесь растворов коллагена в дозе 0,5 мг/кг и адреналина в дозе 0,06 мг/кг. Вещества вводили перорально за 2 часа до моделирования тромбоза в изоэквимоляльных дозах АСК (20мг/кг). При морфологическом исследовании легких мышей оценивали наличие признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа. Гистологические препараты документировали цифровой камерой Olympus (Japan, 4.0 мегапикселей) на базе микроскопа Micros (Austria) c использованием объектива х10, х40 и окуляра х10*

2

.

При изучении влияния веществ на тромбоцитарно-сосудистый гемостаз для определения времени свертывания крови была использована модель «время кровотечения на мышах» [Gratacap, 2009]. По действию на данный параметр соединения были изучены в дозах равных ED50, полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов

Для изучения влияния производных бензимидазола на тромбоцитарно-сосудистый гемостаз при экспериментальном патологии у крыс путем внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 150 мг/кг создавали экспериментальный сахарный диабет, согласно [Chougale, 2007]. Эксперименты проводили на животных с тяжелой формой сахарного диабета, у которых развивалась стойкая гипергликемия с содержанием глюкозы более 15 ммоль/л.

При изучении влияния соединений на агрегацию тромбоцитов и вязкость крови пероральное введение исследуемых соединений проводили ежедневно в течение недели до начала экспериментов, в дозах соответствующих ED50, полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Препарат сравнения гликлазид и пентоксифиллин были изучены в дозе 10 мг/кг и 4 мг/кг.

Влияние препаратов на агрегацию тромбоцитов крыс с аллоксановым диабетом «ex vivo» проводили по методу Born G.(1962) в модификации Габбасова З.А. и др (1989).

Вязкость крови определялась при помощи вискозиметра ротационного типа-анализатора крови реологического (АКР-2) при шести скоростях сдвига (10с-1, 20с-1, 50c-1,100c-1, 200с-1, 300c-1), моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах [Добровольский, 1998]. Влияние веществ на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации эритроцитов (ИАЭ), рассчитываемому как

отношение вязкости крови (ВК) при скорости сдвига 10с-1 к ВК при 300с-1 [Парфенов, 1994]. Вязкость крови определялась при стандартизированном гематокрите -40%.

Модель артериального тромбоза у крыс с экспериментальным диабетом, индуцированного электрическим током, была поставлена согласно методу Guglielmi G. et al. (1991). Производные бензимидазола были изучены в дозах ED50, полученных при исследовании веществ на данной модели у интактных животных.

Влияние производных бензимидазола на агрегацию тромбоцитов in vitro, изучали согласно методу Born G, в модификации Габбасова В.А.(1989). В качестве индукторов агрегации тромбоцитов использовали АДФ и адреналин в конечной концентрации 5мкМ, коллаген - 4 мкг/мл, тромбин - 0,5 ед/мл, агонист тромбоксановых рецепторов - U46619 - 3 мкМ, арахидоновую кислоту - 50 мкМ, кальциевый ионофор - А-23187 – 3мкМ.

Влияние соединений в концентрации 1мкМ на пуриновые P2Y1 и P2Y12-рецепторы тромбоцитов изучали в безкальциевой и кальциевой среде, методом малоуглового светорассеяния [Сакаев, 2000]. Регистрацию проводили на приборе «Лайт-Скан» (НПФ «Люмекс», Россия). В качестве веществ сравнения использовали Reactive blue 2 (Basilen blue) и PPADS.

При изучении влияния производных бензимидазола на баланс «простациклин-ТХА2» в организме крыс, соединения вводились перорально за 2 часа до исследования в дозах, соответствующих ED50, полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Антиагрегационную активность сосудистой стенки крыс ex vivo оценивали по методу D. E. MacIntyre (1978), в модификации В.П. Балуды (1980). Исследования по изучению воздействия соединений на синтез ТХА2 ex vivo проводили по методу J.B. Smith (1976). Измерения проводили на спектрофотометре АPEL PD-303 UV (Япония), при длине волны, равной 532 нм.

Определение изменений уровня внутриклеточного кальция проводили согласно методу, описанному Cho et al. (2006) в отмытых тромбоцитах кролика с использованием флуоресцентного зонда Fura-2/АМ на спектрофлуориметре Hitchi MPF - 400 (Япония) при длине волны возбуждения 340 nm и 380 nm и длине волны испускания 510 nm. В качестве препаратов сравнения были выбраны АСК и антагонист ионов кальция верапамил. В качестве стимулятора выхода интрацеллюлярного кальция их внутриклеточных депо был использован тромбин в концентрации 0,5 ед/мл. Расчет концентрации катионов кальция проводился с помощью уравнения Schaeffer and Blaustein (1989).





Уровень мембраносвязанного кальция в тромбоцитах, измеряли с использованием кальций-чувствительного флуоресцентного зонда хлортетрациклина в концентрации 20 мкМ по методу, описанному Gasvell и Hutchison (1971). Действие соединений на потенциал-зависимые кальциевые каналы изучали на изолированных портальных венах крыс, используя метод гиперкалиевой контрактуры [Golenhofen, 1973].

Эксперименты по изучению влияния производных бензимидазола на коэффициент эндотелиальной дисфункции выполнены на интактных нелинейных крысах и крысах с аллоксановым диабетом по методу Покровского (2006 г.) в дозах, соответствующих ED50, полученных на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Для изучения основных параметров сердечно-сосудистой системы использовалась универсальная компьютерная многоканальная система обработки сигналов в реальном масштабе времени ВЕАТ (РКНПК РАМН, Москва, 2000).

Влияние производных бензимидазола на показатели коагулограммы крови крыс изучалось хронометрически, с помощью турбидиметрического гемокоагулометра «SOLAR» (модель CGL 2110, Белоруссия).

Изучение фармакокинетики*

3 проводили на белых нелинейных крысах самцах массой 200-250 г., которым в хвостовую вену вводили вещество РУ-254, растворенное в физиологическом растворе в дозе 25 мг/кг. Содержание вещества в биологических пробах определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «HEWLETT PACKARD» серии 1050. Для определения в пробах вещества использовали колонку Separon SGX С18 5 мкм (4100) фирмы «Элсико». Детектирование проводили на УФ-детекторе при длине волны 280 nm. Полученные экспериментальные данные анализировались модельно-независимым методом [Gibaldi, 1982].

Исследование острой и хронической токсичности*

4

соединения РУ-254 при внутривенном введении проводилось в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств [Арзамасцев, 2005].

Статистическая обработка данных, полученных при экспериментальных исследованиях, проводилась с помощью программы STATISTICA/w6.0 фирмы StatSoft, Inc. (США) с использованием критерия Манна-Уитни, в электронной таблице Excell 5.0, с использованием t-критерия Стьюдента при помощи пакета статистических программ программного обеспечения Microsoft Excell 2003, 2006. Обсчет результатов исследований по влиянию соединений на выживаемость мышей при моделировании генерализованного тромбоза, проводился с помощью точного критерия Фишера. Статистическую обработку данных гистологических исследований проводили с использованием программы «Видео Тест Морфо-4. Площадь под фармакокинетической кривой (AUC) рассчитывали с помощью смешанного линейно-логарифмического метода статистических моментов [Пиотровский, 1986].

Анализ зависимости между биологической активностью и химической структурой производных бензимидазола проводился с применением методов теории распознавания образов [Горелик, 1984]. Для выявления QSAR-закономерностей использовались два метода: подструктурный анализ и частотный анализ физико-химических параметров соединений. Кластеризация осуществлялась двумя методами: вероятностным методом гистограмм и геометрическим методом расстояний [Мандель, 1988]. Показатели липофильности вычислялись с применением различных схем фрагментного приближения [Broto, 1984; Ghose, 1987; Viswanadhan, 1989]. Cтерические параметры рассчитывались с использованием классической аддитивной схемы в различных модификациях [Иоффе, 1983; Ghose, 1987; Viswanadhan, 1989].

Вычисление электронных характеристик проводили согласно методу AM1 [Dewar, 1985; Минкин, 1997], с предварительной оптимизацией конформации методом молекулярной механики MM2 [Буркерт, 1986; Кларк, 1990].

Компьютерный прогноз биологической активности новых производных бензимидазола осуществляли с использованием системы PASS [Филимонов, 2006] и информационной технологии «Микрокосм» [Васильев, 2005]. Расчеты были выполнены с помощью программы Pro 2006 (версия SAR-базы 2009 г.), разработанной в НИИ БМХ РАМН (Москва) и с помощью разработанного в ВолгГМУ оригинального программного комплекса ИТ «Микрокосм» (версия 5.1, 2009г.)*

5.

Прогноз биологической активности методом сходства к эталонам проведен на основе вычисления средних коэффициентов 2D- и 3D-сходства структуры изучаемого соединения к структурам специально выбранных препаратов сравнения с известным механизмом действия [Molecular Similarity..., 1995]. В качестве препаратов-стандартов были выбраны ингибиторы кальмодулина (хлорпромазин гидрохлорид, кальмидазолиум хлорид, феноксибензамина гидрохлорид), ингибиторы ФДЭ цАМФ III типа (цилостазол, трапидил, пентоксифиллин, дипиридамол), ингибиторы ТХА2-синтетазы (дазоксибена гидрохлорид, ридогрел, мидазогрел) и стимуляторы аденилатциклазы (букладесин натрия, форскалин и вещество NKH 477 гидрохлорид). Расчеты выполнены с помощью программы HyperChem 7 (Evaluation Copy).

Докинг производных бензимидазола в сайты связывания различных белков – мишеней: кальмодулина, фосфодиэстеразы III типа, тромбоксансинтетазы А2 и аденилатциклазы выполнялся с использованием программного пакета AutoDock Vina 1.1.1 [AutoDock Vina, 2010] в комплекте с дополнительными инструментами AutoDock Tools и PyMol [Trott O, 2010] на имеющемся в ВолгГМУ 24-х ядерном вычислительном кластере общей производительностью 190 Гфлопс.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальный поиск веществ с антиагрегантной активностью in vitro был проведен среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола, представленных 14 классами. На основании величины рассчитанного условного терапевтического индекса, из данной группы веществ было выбрано 11 наиболее активных соединений, превосходящих препарат сравнения АСК (табл. 1). В результате этого выявлено вещество под шифром РУ-891, проявляющее высокую антиагрегантную активность. По EC50 данное соединение превосходит АСК 5,5 раза, а по терапевтическому индексу в 10 раз.

Таблица 1. Влияние производных бензимидазола и АСК на АДФ-индуцированную (5мкМ) агрегацию тромбоцитов кролика in vitro - ЕС50, острая токсичность-LD50 (в/бр, мг/кг) и условный терапевтический индекс(УТИ) исследуемых веществ.

№ п/п Название соединения ЕС50, М ЕС50, мг/л LD50, мг/кг (в/бр) УТИ (LD50/ЕС50)
РУ-891 0,000133 51,87 1260,0 24,27
РУ-451 0,000259 127,03 1000,0 7,87
РУ-295 0,000240 104,47 598,0 5,72
РУ-502 0,000183 85,16 400,0 4,69
РУ-487 0,000133 67,05 263,0 3,92
РУ-1202 0,000139 58,83 205,3 3,48
РУ-659 0,000151 47,36 153,0 3,22
РУ-254 0,000269 89,11 275,0 3,0
РУ-670 0,000230 83,32 236,0 2,83
РУ-17 0,000154 64,26 164,0 2,55
РУ-185 0,000331 174,1 218,0 1,25
12. АСК 0,00071 128,5 310 2,41


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.