WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 ||

Орексинэргические нейроны гипоталамуса крыс wistar после введения липополисахарида

-- [ Страница 2 ] --

E – эффективность протекания реакции в конкретной пробе.

C(t) – пороговый показатель циклов (количество циклов необходимое для достижения порогового значения флюоресценции).

Эти параметры были рассчитаны встроенным программным обеспечением амплификатора.

Электрофорез в агарозном геле.

Контроль специфичности полученного после ПЦР продукта осуществляли при помощи электрофореза в агарозном геле. Для постановки электрофореза амплифицированных фрагментов готовили 2% агарозу на 1хТАЕ буфере. В качестве электродного буфера использовали 1хТАЕ буфер. Электрофоретическое разделение проводили в направлении от катода к аноду при напряженности электрического поля 10 В/см геля в течение 30-40 мин. По окончанию разделения гель фотографировали при помощи установки для документации результатов ПЦР-анализа (Gel Imager) с использованием трансиллюминатора с длиной волны 260-340 нм.

Статистическая обработка данных

Для статистической обработки полученных результатов были использованы программы Statistica и SPSS 11.0, а также пакет программ Microsoft Office 2003. Сравнение групп экспериментальных животных проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Для сравнения количества орексин-содержащих нейронов на срезах мозга использовали средние взвешенные величины, а также осуществляли ранжирование срезов по количеству клеток и строили кривые распределения для каждой экспериментальной группы животных.

результаты исследования и их обсуждение

Количество c-Fos-позитивных нейронов гипоталамуса после введения липополисахарида.

Активацию гипоталамических структур оценивали по наличию белка c-Fos в нейронах. Количество c-Fos-позитивных клеток определяли в латеральной гипоталамической области (LHA), где локализовано наибольшее количество орексин-содержащих нейронов, а также в структурах с высокой плотностью рецепторов к орексину и орексин-содержащих отростков: паравентрикулярном (PVH), переднем гипоталамическом (AHN), дорзомедиальном (DMH), вентромедиальном (VMH) ядрах и заднем гипоталамическом поле (PH) (рис. 1).

У животных, которым внутривенно вводили антиген (ЛПС) в дозе 25 мкг/кг, происходило увеличение числа активированных нейронов во всех исследуемых структурах гипоталамуса. Инъекции большей дозы ЛПС приводили к увеличению активации нейронов AHN, PVH, LHA и PH; уровень активации в VMH и DMH не отличался от уровня активации этих структур у животных после введения физиологического раствора (рис. 2). Поскольку по абсолютному количеству c-Fos-позитивных клеток нельзя сравнить между собой различные гипоталамические структуры по степени активации, сравнение проводилось по относительному коэффициенту активации (ОКА). Высокий уровень активации нейронов после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг констатирован в AHN, PVH, LHA и PH. Введение 500 мкг/кг ЛПС приводит к более выраженному ответу только в AHN, PVH и LHA (рис. 3, 4). Таким образом, можно предположить, что степень активации клеток гипотоламических структур зависит от дозы вводимого препарата. Как известно, введение ЛПС инициирует развитие комплекса системных ответов организма (активацию гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси, лихорадку, изменение пищевого поведения), в процесс регуляции которых вовлечены указанные гипоталамические структуры. Отличие в паттерне их активации при введении различных доз ЛПС, вероятно, может быть связано с разной интенсивностью иммунных процессов, развивающихся в ответ на введение антигена в разных дозах и возможно, определяющих различную степень и паттерн активации структур ЦНС.

Для выяснения морфо-функциональных особенностей нейронов участвующих в механизмах реализации реакций мозга на антиген проведено ранжирование c-Fos-позитивных клеток, локализованных в LHA согласно их размерам. При введении малой дозы ЛПС происходит в основном активация клеток меньших размеров (10–50 мкм2; класс 1, 2), соответствующих нейронам ассоциативного типа, аксоны которых проецируются на клетки, расположенные внутри данной структуры, в то время как при введении 500 мкг/кг ЛПС наблюдается активация и более крупных клеток (>50 мкм2; класс 3 и выше), в том числе, клеток релейного типа (70–150 мкм2), образующих проекции вне LHA (рис. 5), что обуславливает возможность передачи сигнала к другим структурам мозга, и формированию системного ответа, характерного для реакции на введение ЛПС.

 Схемы гипоталамуса мозга крысы на 25, 28 и 30 уровнях. AHN —-0  Схемы гипоталамуса мозга крысы на 25, 28 и 30 уровнях. AHN —-1

 Схемы гипоталамуса мозга крысы на 25, 28 и 30 уровнях. AHN —-2

Рисунок 1. Схемы гипоталамуса мозга крысы на 25, 28 и 30 уровнях.

AHN — переднее ядро; PVH — паравентрикулярное ядро; LHA — латеральная гипоталамическая область; DMH — дорзомедиальное ядро; VMH — вентромедиальное ядро;PH — заднее ядро (Swanson, 2004).

 Количество c-Fos позитивных клеток в гипоталамаческих структурах-3

Рисунок 2. Количество c-Fos позитивных клеток в гипоталамаческих структурах мозга крыс после введения ЛПС.

По оси абсцисс — структуры гипоталамуса.

По оси ординат — количество c-Fos-позитивных клеток на 10000 мкм2 среза мозга

Группы животных:

— интактные

после введения:

—физиологического раствора

—25 мкг/кг липополисахарида

—500 мкг/кг липополисахарида

* — P<0,01; ** — P<0,05 по отношению к их количеству у животных после введения физиологического раствора;

# — P<0,01; ## — P<0,05 по отношению к их количеству у животных после введения 25 мкг/кг ЛПС;

† — P<0,05 по отношению к их количеству у интактных животных.

 Относительные коэффициенты активации гипоталамических структур-8

Рисунок 3. Относительные коэффициенты активации гипоталамических структур мозга крыс после введения ЛПС (25 мкг/кг).

По оси абсцисс — структуры гипоталамуса.

По оси ординат — относительный коэффициент активации гипоталамических структур по количеству c-Fos-позитивных клеток на 10000мкм2.

* — P<0,01; ** — P<0,05 по отношению к значению ОКА VMH и DMH;

# — P<0,05 — P<0,05 по отношению к значению ОКА PVH

 Относительные коэффициенты активации гипоталамических структур-9

Рисунок 4. Относительные коэффициенты активации гипоталамических структур мозга крыс после введения ЛПС (500 мкг/кг).

По оси абсцисс — структуры гипоталамуса.

По оси ординат — относительный коэффициент активации гипоталамических структур по количеству c-Fos-позитивных клеток на 10000мкм2.

* — P<0,01 по отношению к значению ОКА DMH, VMH, LHA, PH;

# — P<0,05 по отношению к значению ОКА DMH, VMH, PH

 Распределение c-Fos позитивных клеток LHA, ранжированных согласно-10

Рисунок 5. Распределение c-Fos позитивных клеток LHA, ранжированных согласно их площади, после введения ЛПС.

По оси абсцисс — классы c-Fos позитивных клеток:

Класс 1 — 10-30 мкм2 Класс 5 — 91-110 мкм2
Класс 2 — 31-50 мкм2 Класс 6 — 111-130 мкм2
Класс 3 — 51-70 мкм2 Класс 7 — 131-150 мкм2
Класс 4 — 71-90 мкм2 Класс 8 — 151-170 мкм2




По оси ординат — % c-Fos-позитивных клеток определенного класса.

Животные после введения:

— физиологического раствора

— ЛПС (25 мкг/кг)

— ЛПС (500 мкг/кг)

Орексин-позитивные нейроны гипоталамуса после введения ЛПС.

Количество орексин-позитивных нейронов определяли на срезах мозга с 24 по 34 уровень (рис. 6). Так как в литературе имеются данные об изменении количества мРНК препроорексина в орексин-содержащих нейронах гипоталамуса в течение суток (Taheri S. et al, 2000), то предварительно было проведено определение распределения орексин-содержащих нейронов в гипоталамусе интактных крыс в различное время дня (11, 13, 15 и 17 часов), но изменений количества орексин-позитивных нейронов мы не выявили. Для дальнейшего анализа были выбраны срезы 28, 29 и 30 уровней (по атласу Swanson’s), так как на этих уровнях локализовано наибольшее количество клеток, содержащих орексин.

Введение малой дозы ЛПС (25 мкг/кг) привело к изменению количества орексин-позитивных нейронов. Через 2 и 4 часа после введения ЛПС наблюдалось увеличение количества орексин-позитивных нейронов на срезах мозга 29 уровня, а через 6 часов — снижение их числа на срезах мозга 28 уровня (рис. 7). После введения ЛПС в дозе 500 мкг/кг на срезах мозга 29 уровня через 2 часа наблюдалась только тенденция к увеличению количества орексин-позитивных нейронов, и лишь через 6 часов после введения данной дозы антигена было выявлено уменьшение их числа на всех анализируемых уровнях (рис. 7).

Выявленную закономерность подтвердило и сравнение усредненных кривых распределения количества орексин-позитивных нейронов на срезах мозга у животных всех групп (рис 8, 9).

Через 2 и 4 часа после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг кривые распределения количества орексин-позитивных нейронов на срезах мозга 29 уровня сдвигаются в сторону больших величин по сравнению с кривыми их распределения у животных после введения физиологического раствора, что обусловлено преобладанием срезов мозга с большим количеством орексин-позитивных нейронов у животных после введения данной дозы ЛПС (рис 8). После введения ЛПС в дозе 500 мкг/кг также выявлено смещение кривых распределения в сторону больших значений по сравнению с кривыми их распределения у животных после введения физиологического раствора, хотя при сравнивании этих групп животных по средним величинам была выявлена только слабая тенденция (P=0,09) к увеличению количества орексин-позитивных нейронов.

Через шесть часов после введения ЛПС в дозе 25 мкг/кг кривые распределения количества орексин-позитивных нейронов на срезах мозга только 28 уровня, а при введении ЛПС в дозе 500 мкг/кг – 28, 29 и 30 уровней, сдвигаются в сторону меньших величин по сравнению с кривыми их распределения после введения физиологического раствора, что определяется превалированием срезов мозга с меньшим количеством орексин-позитивных нейронов у животных данных экспериментальных групп (рис 9).

Изменения количества орексин-позитивных нейронов отражают различия в содержании орексина в этих клетках, достаточное или недостаточное для иммуногистохимического выявления орексин-содержащих нейронов в гипоталамических структурах на срезах мозга. Изменения содержания орексина в нейронах могут быть обусловлены смещением баланса процессов его синтеза и потребления. Повышение содержания орексина в нейронах может быть следствием как возросшего синтеза этого нейропептида, так и снижением его утилизации. Соответственно уменьшение содержания орексина в нейронах может объясняться либо его сниженным синтезом, либо усилившимся потреблением. Определение уровня экспрессии гена препроорексина дает возможность достаточно определенно судить, какой из указанных механизмов лежит в основе выявленных изменений.


Рисунок 6. Распределение орексин-содержащих нейронов в гипоталамусе крыс Wistar.

Представлены схемы срезов 24-34 уровней мозга. (Swanson’s, 2004).

Точками указаны орексин-содержащие нейроны, цифры на схемах соответствуют уровням срезов.

 A B C D E F Динамика изменения количества-15  A B C D E F Динамика изменения количества-16

A B

 C D E F Динамика изменения количества орексин-позитивных-17  C D E F Динамика изменения количества орексин-позитивных-18

C D

 E F Динамика изменения количества орексин-позитивных нейронов в-19  E F Динамика изменения количества орексин-позитивных нейронов в-20

E F

Рисунок 7. Динамика изменения количества орексин-позитивных нейронов в гипоталамических структурах на срезах мозга через 2, 4 и 6 часов после введения ЛПС.

Введение физиологического раствора и ЛПС проводили в 11.00.



Pages:     | 1 ||
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.