WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Влияние рекомбинантного белка вируса натуральной оспы на биологические эффекты фактора некроза опухолей альфа

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Басова

Алёна Александровна

ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА

ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ

НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном

учреждении «Научно-исследовательский институт

клинической иммунологии» Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Орловская Ирина Анатольевна


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Аутеншлюс Александр Исаевич

кандидат биологических наук Королькова Ольга Юрьевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения РАМН (г. Томск)




Защита состоится «_1_» марта 2012 года в _16.00_ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «_27__» __января_________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Ольга Петровна Колесникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ключевую роль в развитии воспалительного процесса играют цитокины, в частности, TNF-, IL-1, IL-6, интерфероны. Особое внимание придают провоспалительным свойствам TNF-, гиперпродукция которого приводит к развитию хронических воспалительных заболеваний, в том числе аутоиммунной природы. К числу заболеваний, при которых наблюдается гиперпродукция TNF-, относятся ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, болезнь Крона, системная красная волчанка, полимиозит, дерматомиозит, псориаз, атопический дерматит и многие другие. Наиболее веские доказательства патогенетического значения TNF- получены при ревматоидном артрите, характеризующемся неуклонно прогрессирующим поражением суставов и внутренних органов. Под действием TNF- повышается функциональная активность нейтрофилов, в том числе мигрировавших в сустав с образованием активных форм кислорода и высвобождением лизосомальных ферментов, которые оказывают повреждающее действие на хрящевую и костную ткань. Хронические воспалительные процессы часто сопровождаются формированием анемии. В основе патогенеза анемии хронических заболеваний лежат TNF-опосредованные нарушения пролиферации эритроидных предшественников, продукции эритропоэтина. Таким образом, среди широкого спектра провоспалительных медиаторов, участвующих в развитии воспалительных процессов, особое внимание привлечено к TNF- - основному цитокину, определяющему развитие воспаления [Насонов Е. Л., 2003].

В качестве подходов к антицитокиновой стратегии этих заболеваний используют различные ингибиторы TNF- на основе генно-инженерных продуктов, которые блокируют биологическую активность этого цитокина. [Kremer J.M. et al., 2003, Redlich K. et al., 2003]. Необходимость расширения спектра анти-TNF- препаратов диктуется тем, что существующие анти-TNF- препараты обладают разной терапевтической эффективностью. Несмотря на достигнутые первые успехи в лечении воспалительных процессов, патогенетическое обоснование использования анти-TNF- терапии остается важнейшей задачей. Известные в настоящее время ингибиторы TNF- продемонстрировали относительно высокую эффективность в процессе контролируемых исследований терапии РА [Gartlehner G. et al., 2006, Kirou K. A. et al., 2006], но в реальной клинической практике около 30–40% пациентов рефрактерны к терапии этими препаратами, менее чем у половины удается достигнуть полной или частичной ремиссии, а около 1/3 вынуждены прекращать лечение из-за развития вторичной неэффективности или побочных эффектов через 2–3 года терапии. Лечение известными в настоящее время ингибиторами TNF- может сопровождаться развитием инфекционных осложнений, в первую очередь туберкулезной инфекции. [Dixon W.G. et al., 2006] Следовательно, существует необходимость создания препаратов нового типа, более безопасных и эффективно блокирующих активность TNF-.

Цель исследования: Оценка in vitro и in vivo гемопоэз-модулирующей и противовоспалительной функций TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы.

Задачи исследования:

  1. Исследовать влияние вирусного белка (VARV-CrmB) на TNF-зависимые изменения колониеобразующей активности костномозговых гемопоэтических предшественников мыши и человека.
  2. Исследовать влияние VARV-CrmB на TNF-зависимые изменения окислительно-метаболической активности и продукции IL-1 и IL-6 мононуклеарными клетками (МНК) человека.
  3. Исследовать влияние VARV-CrmB на клинические проявления, костномозговой гемопоэз и окислительно-метаболическую функцию лейкоцитов крови в модели коллаген-индуцированного артрита (КИА).
  4. Исследовать костномозговой гемопоэз, окислительно-метаболическую и миграционную функции лейкоцитов крови мышей при эпикутанном воздействии VARV-CrmB.

Научная новизна



Впервые показано, что в культуре клеток костномозговых гемопоэтических предшественников действие VARV-CrmB приводит к восстановлению TNF-индуцированного снижения количества эритроидных колоний и повышению численности гранулоцитарных колоний мыши до исходного уровня. Воздействие VARV-CrmB дозозависимым образом восстанавливает TNF-обусловленное снижение колониеобразующей способности гемопоэтических предшественников человека.

Установлено, что предварительная соинкубация TNF- и VARV-CrmB полностью отменяет стимулирующий эффект TNF- на продукцию IL-1 и IL-6 в культуре МНК человека.

Впервые показано, что белок VARV-CrmB отменяет TNF-индуцированную генерацию активных метаболитов кислорода лейкоцитами мыши и человека.

На модели коллаген-индуцированного артрита (КИА) впервые продемонстрировано, что введение мышам VARV-CrmB приводит к снижению степени активности артрита, коллагенолитической активности сыворотки (КАС) и содержания гликозаминогликанов (ГАГ) на ранних сроках развития КИА. Введение VARV-CrmB приводит к снижению численности нейтрофильных гранулоцитов и гранулоцитарных предшественников, а также к достоверному снижению окислительно-метаболической активности лейкоцитов на ранних сроках развития КИА.

Впервые показано, что эпикутанное воздействие VARV-CrmВ нормализует повышенную миграционную и окислительно-метаболическую активность лейкоцитов rmTNF-обработанных мышей. При эпикутанном воздействии VARV-CrmB оказывает корригирующие эффекты в отношении TNF-зависимых изменений колониеобразующей активности гемопоэтических предшественников.

Теоретическая и практическая значимость работы

Изучение влияния рекомбинантного белка вируса натуральной оспы на реализацию биологических эффектов TNF- позволило выявить новые закономерности в регуляции гемопоэз-модулирующей и противовоспалительной функций этого цитокина.

Результаты исследования обосновывают новые подходы в лечении заболеваний человека, основанные на использовании вирусных белков. Белки вируса натуральной оспы, оказывающие влияние на биологические эффекты фактора некроза опухолей, являются перспективными для разработки нового метода антицитокиновой стратегии лечения заболеваний человека.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Белок VARV-CrmB восстанавливает TNF-зависимые изменения колониеобразующей активности гемопоэтических предшественников и окислительно-метаболической функции лейкоцитов мыши и человека.
  2. Белок VARV-CrmB оказывает противовоспалительный эффект на ранних сроках формирования коллаген-индуцированного артрита.

Личный вклад автора в проведение исследования. Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», г. Новосибирск (2010 год), 8-ой итоговой конференции НИИКИ СО РАМН «Иммуногенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (2011 год). Апробация диссертации состоялась 30 августа 2011г. на семинаре Института клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в журналах, определенных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 127 страницах машинописного текста, включающего 12 таблиц и 27 рисунков. Библиография содержит ссылки на 183 литературных источника, в том числе 152 иностранных. Работа выполнена на базе лаборатории иммунобиологии стволовой клетки отдела экспериментальной иммунологии Института клинической иммунологии СО РАМН.


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реактивы и среды. В работе использовались rmTNF-, rhTNF-, выделенные из бактериального штамма-продуцента (1,5 мг/мл, 3х107 МЕ) [Пустошилова Н.М., 1994]. Выделение рекомбинантного VARV-CrmB (0,2 мг/мл) проводили по методу, описанному в работе [Лебедев Л.Р., 2001]. Поликлональные антитела к TNF- (TNF АТ) получали путем иммунизации кроликов mrTNF- и rhTNF-. Использовались: моноклональные антитела к TNF- компании «R&D System», среда М 3434 (Stem Cell Technology, Canada), среда Metho Cult GF Н 4434 (Stem Cell Technology, Canada), среда RPMI-1640, бычий коллаген II типа («Sigma»). Поликлональные антитела к TNF-, rmTNF-, rhTNF-, VARV-CrmB были предоставлены ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Животные. В экспериментах использовали мышей линии (CBAxC57Bl/6)F-1 в возрасте 2-6 мес., полученных из лаборатории экспериментальных животных НИИКИ СО РАМН. Животных содержали и выводили из эксперимента в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).





Оценка числа коммитированных предшественников клеток костного мозга человека. Оценка производилась на донорских клетках костного мозга (ККМ) человека, которые были предоставлены НИИКИ СО РАМН. Для определения числа коммитированных предшественников ККМ в концентрации 2,5х104/мл инкубировали на 24-луночных планшетах с использованием метилцеллюлозной среды Metho Cult GF Н 4434 (Stem Cell Technology, Canada), содержащей rSCF, rGM-CSF, rIL-3, rEpo. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), эритроидные (БОЕ-Э, КОЕ-Э) и гранулоцитарно-эритроцитарно-макрофагально-мегакариоцитарные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывали под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 37OС, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2 согласно рекомендациям Stem Cell Techologies, Canada.

Оценка числа коммитированных предшественников клеток костного мозга мышей линии (CBAxC57Bl/6)F1. Клетки костного мозга в концентрации 2,5х104/мл инкубировали на 24-луночных планшетах в метилцеллюлозной среде М 3434 (Stem Cell Technology, Canada), содержащей цитокины SCF, EPO, IL-3, IL-6. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), эритроидные (БОЕ-Э, КОЕ-Э) и гранулоцитарно-эритроцитарно-макрофагально-мегакариоцитарные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывали под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при 37OС, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2 согласно рекомендациям Stem Cell Techologies, Canada.

Облучение животных. Облучение животных производили на аппарате РУМ-25 при мощности 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока 10мА. Летальная доза составляла 8.5 Гр.

Определение количества колониеобразующих единиц селезенки КОЕ-с8. Клетки костного мозга в количестве 0,5х105/мышь вводили внутривенно летально облученным реципиентам. На 8-е сутки производили забой реципиентов, после фиксации селезенок в реагенте Телесницкого подсчитывали число макроскопически видимых колоний в селезенках.

Количество форменных элементов периферической крови (лейкоцитов и тромбоцитов) определяли с помощью гематологического анализатора ERMA PCI90 (Япония). Относительное количество форменных элементов крови подсчитывали на мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе.

Коллаген-индуцированный артрит (КИА) моделировали на мышах линии (CBAxC57Bl6)F1 с использованием бычьего коллагена II типа («Sigma»). В заднюю часть спины мышей подкожно вводили 45 мкг коллагена II типа с полным адъювантом Фрейнда («Difco») и через 18 суток повторно вводили коллаген II типа (45 мкг) с неполным адъювантом Фрейнда («Difco») в основание хвоста в 4-6 точках [Paul-Clark M.J. et al., 2002]. Всего каждому животному вводили по 90 мкг коллагена II типа. Поли-AbTNF и VARV-CrmB вводили мышам через 4 часа после разрешающей инъекции коллагена II типа, когда в крови животных увеличивается концентрация TNF [Kirou K. A. et al., 2006].

Животные были разделены на 4 группы: I-я – контрольная (животным вводили физ. раствор), II-я – мыши с КИА, III-я – животные с КИА, которым внутрибрюшинно вводили поликлональные антитела к TNF (поли-AbTNF) по 2 мкг/мышь (группа сравнения) и IV-я – мыши с КИА, которым внутрибрюшинно вводили по 2 мкг рекомбинантного TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы VARV-CrmB (основная группа).

Оценка степени активности КИА. Характер и степень активности КИА оценивали по 4-точечной шкале на каждой конечности. Критериями шкальной оценки активности КИА были: 0 - нормальный вид суставов и сохраненный объем движения в суставах; 1 - эритемы и отек конечностей; 2 - видимая деформация суставов; 3 - анкилоз суставов при сгибании [Inglis J.J. et al., 2007].

Оценка структурно-метаболических изменений соединительной ткани. О структурно-метаболических изменениях соединительной ткани в динамике развития КИА судили по коллагенолитической активности сыворотки (КАС) крови мышей и по суммарному содержанию гликозаминогликанов (ГАГ) [Шараев П.Н., 1987, Шараев П.Н., 1987]. Величины КАС и ГАГ выражали в микромолях оксипролина на 1 л сыворотки крови за 1 час (мкмоль оксипролина/л) и микромолях гексуроновой кислоты в 1 л сыворотки (мкмоль/л) соответственно. Оценка КАС и уровня ГАГ была проведена на базе кафедры биохимии НГМУ.

Оценка окислительно-метаболической функции лейкоцитов. МНК крови 6 здоровых доноров, выделенных в градиенте фиккол-урографина (р=1,077), культивировали в количестве 106/мл в RPMI-1640 c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гентамицина 80 мкг/мл, 2мМ L-глутамина, 5х10-5 мМ меркаптоэтанола. Для оценки нейтрализующей активности использовали различные концентрации антител (полиAbTNF – 1000, 100, 50, 8 нг/мл и моноAbTNF – 100 и 50 нг/мл) и белка VARV-CrmB (100, 50, 10, 8 нг/мл), которые предварительно инкубировались с TNF- при 37оС в течение 3 часов. После инкубации образцы растворов добавляли в культуру МНК. Во всех исследованиях использовали 2 нг/мл TNF.

Окислительно-метаболическую (ОМ) функцию МНК крови здоровых доноров оценивали с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) [Tono-oka T. et al., 1983]. Измерение интенсивности ХЛ ответа МНК проводили с помощью мультимодального планшетного ридера «LB 941 TriStar» («Berthold Technologies», Германия). Результаты ХЛ исследования выражали как суммарный ХЛ ответ МНК – Isum = имп/103 МНК/30 мин, где n – число импульсов, испускаемых МНК в течение 30 минутного исследования, а также регистрировали его максимальное значение – Imax.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.