WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Влияние рекомбинантного белка вируса натуральной оспы на биологические эффекты фактора некроза опухолей альфа

-- [ Страница 2 ] --

Оценка содержания цитокинов IL-1 и IL-6 в кондиционной среде культуры МНК. Содержание цитокинов IL-1 и IL-6 в кондиционной среде культуры донорских МНК оценивалось через 24 часа инкубации с помощью коммерческих тест-систем ИФА («Вектор-Бест», Новосибирск). Измерение IL-1 и IL-6 проводили с помощью мультимодального планшетного ридера «LB 941 TriStar» («Berthold Technologies», Германия).

Оценка миграции лейкоцитов при эпикутанных аппликациях. Эпикутанную аппликацию rmTNF и VARV-CrmB на дорзальную поверхность обоих ушей мышей в объёме 25 мкл/ухо проводили по [Cumberbatch M. et al., 2005]. Животные были разделены на 4 группы: I-я (контрольная) группа - эпикутанная обработка фосфатным солевым раствором (PBS); II-я группа – эпикутанная аппликация rmTNF в дозе 500 нг/мышь; III-я группа – обработка рекомбинантным VARV-CrmB в дозе 500 нг/мышь; IV группа – 500 нг rmTNF + 500 нг VARV-CrmB спустя 30 мин. Животных выводили из эксперимента через 2, 24 и 72 ч после эпикутанной аппликации rmTNF и VARV-CrmB. Для оценки миграции клеток из кожного эксплантата уши промывали 70% этанолом, отделяли дорзальную часть кожи уха и помещали дермальной стороной вниз в ячейку 24-луночного планшета с 1 мл полной среды RPMI1640. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Затем клетки отсасывали в центрифужные пробирки, вносили в каждую лунку по 100 мкл культуральной среды с 0,25% трипсином, инкубировали при 37 С, затем вносили по 200 мкл полной среды RPMI1640, смывали прилипшие клетки и объединяли с первой порцией клеток в центрифужных пробирках. Клетки концентрировали центрифугированием при 1500 об/мин. Количество клеток, мигрировавших из одного уха, подсчитывали в камере Горяева.

При проведении исследований на МНК и ККМ у всех доноров было получено информированное согласие на использование данных обследования в научных целях и согласие этического комитета на проведение исследования. В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000) и Правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка материала осуществлялась пакетом лицензированных программ Excel 7,0 и Statistica 5,0 с использованием среднего арифметического, ошибки средней, критерия Стьюдента. Результаты считались достоверными при p<0,05.


РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование влияния VARV-СrmB

на колониеобразующую активность ККМ мышей.

Для того чтобы оценить TNF-блокирующие свойства белка VARV-CrmB был проведен ряд экспериментов на модели костномозгового гемопоэза мыши при воздействии rTNF-.

Было обнаружено, что VARV-CrmB в отсутствие rmTNF- не оказывает эффекта на костномозговой гемопоэз мыши (количество эритроидных и гранулоцитарно-макрофагальных колоний под воздействием VARV-CrmB достоверно не изменялось), что можно интерпретировать как отсутствие токсического эффекта изучаемого белка на гемопоэтические предшественники (рис. 1).

 Влияние СrmB на колониеобразующую активность ККМ мышей-0

Рис. 1. Влияние СrmB на колониеобразующую активность ККМ мышей BALB/c.

Из данных представленных на рисунке 2 видно, что внесение rmTNF- в различных концентрациях в культуру ККМ мыши приводило к достоверному снижению количества эритроидных предшественников (БОЕ-Э+КОЕ-Э). Вместе с тем при воздействии rmTNF- в концентрации 2 нг/мл наблюдалось достоверное увеличение числа КОЕ-ГМ по сравнению с контролем (культуральная среда), а при воздействии rmTNF- в концентрации 10 нг/мл не наблюдалось достоверного увеличения числа КОЕ-ГМ. Для исследования влияния VARV-CrmB на rmTNF-индуцированные изменения констномозгового гемопоэза была выбрана концентрация rmTNF- 2 нг/мл.

В дальнейших экспериментах исследовалось влияние рекомбинантного белка-антагониста TNF (VARV-CrmB) в различных концентрациях на rmTNF-индуцированные изменения колониеобразующей активности ККМ (рис. 3).

Следствием воздействия rmTNF- (2 нг/мл) в данной серии экспериментов было достоверное снижение количества эритроидных колоний (БОЕ-Э+КОЕ-Э) и достоверное повышение количества КОЕ-ГМ по сравнению с контролем. Воздействие VARV-CrmB приводило к дозозависимому усилению эритроидного колониеобразования и восстановлению количества КОЕ-ГМ до контрольного уровня.

 Влияние rmTNF на колониеобразующую активность ККМ мышей.-1

Рис. 2. Влияние rmTNF на колониеобразующую активность ККМ мышей. * - Достоверное снижение относительно контроля (р<0.05)

** Достоверное повышение относительно контроля (р<0.05)

 Влияние VARV-CrmB на rmTNF-индуцированные изменения-2

Рис. 3. Влияние VARV-CrmB на rmTNF-индуцированные изменения колониеобразующей активности ККМ мышей. 1: контроль, 2: 2 нг/мл rmTNF, 3 -5: 2 нг/мл rmTNF+2нг/мл, 6 нг/мл и 12 нг/мл CrmB.



# Достоверное снижение относительно контроля (р < 0.05)

## Достоверное повышение относительно контроля (р < 0.05)

* Достоверное повышение относительно 2 нг/мл rmTNF- (р < 0.05)

Исследование влияния VARV-СrmB на колониеобразующую

активность ККМ человека.

Были проведены эксперименты по исследованию влияния рекомбинантного белка-антагониста TNF- (VARV-CrmB) в различных концентрациях на rhTNF-индуцированные изменения колониеобразующей активности ККМ человека (рис.4). Предварительно было установлено, что rhTNF- (2 нг/мл) достоверно снижал количество эритроидных и гранулоцитарно-макрофагальных колоний в культуре ККМ человека. Добавление в культуру клеток VARV-CrmB в дозе 2 нг/мл не оказывало влияние на rhTNF-индуцированное снижение количества гемопоэтических предшественников. А в дозах 6 и 12 нг/мл VARV-CrmB дозозависимым образом повышал исследуемые показатели, отменяя эффект rhTNF-.

Рис. 4. Влияние VARV-CrmB на rhTNF-индуцированные изменения колониеобразующей активности ККМ человека. 1: контроль, 2: 2 нг/мл rhTNF, 3 -5: 2 нг/мл rhTNF+ 2 нг/мл, 6 нг/мл и 12 нг/мл CrmB.

* - относительно контроля (р < 0.05); ** - относительно 2 нг TNF- (р < 0.05)

Оценка влияния VARV-CrmB на функциональную

активность мононуклеарных клеток.

Биологическая активность TNF- опосредуется связыванием со специфическими рецепторами, экспрессированными на различных клетках, Поэтому было проведено исследование по оценке способности VARV-CrmB отменять эффекты TNF- на функциональную активность мононуклеарных клеток человека.

Было показано, что предварительная соинкубация TNF- и белка VARV-CrmB в различных концентрациях (100 нг/мл и 10 нг/мл) полностью отменяет эффекты TNF- на продукцию IL-1 и IL-6 в культуре МНК, а концентрации IL снижалась до уровня спонтанной продукции (табл. 1). При изучении влияния TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы (VARV-CrmB) на TNF-индуцированную генерацию активных метаболитов кислорода установлено, что тестируемый белок отменяет TNF-стимулированный хемилюминесцентный ответ клеток (табл. 2).

Таблица 1. Содержание цитокинов IL-1 и IL-6 в кондиционной среде культуры МНК условно здоровых доноров через 24 ч после добавления в среду различных стимуляторов (M± m), n=6.

Группы IL-1, пкг/мл IL-6, пкг/мл
Спонтанная (без стимулятора) 3,1±1,1b 112,8±21,2b
TNF 2 нг/мл 764,9±197,0a 1525,8±45,3a
VARV-CrmB 100 нг/мл 8,7±1,4a,b 186,1±32,5b
VARV-CrmB 50 нг/мл 9,5±4,0b 215,4±84,6b
VARV-CrmB 10 нг/мл 4,3±1,0b,c 107,2±19,2b
TNF 2 нг/мл+полиAbTNF 1000 нг/мл 4,9±1,3b 155,0±31,4b
TNF 2 нг/мл+полиAbTNF 100 нг/мл 8,1±1,7b 182,2±40,5b
TNF 2 нг/мл+полиAbTNF 50 нг/мл 18,7±13,2b 181,5±52,1b
TNF 2 нг/мл+моноAbTNF 100 нг/мл 8,2±1,8a,b 170,4±37,1b
TNF 2 нг/мл+моноAbTNF 50 нг/мл 50,3±16,4a,b 957,2±201,8a,b
TNF 2 нг/мл+VARV-CrmB 100 нг/мл 6,8±1,3b 164,3±37,7b
TNF 2 нг/мл+VARV-CrmB 10 нг/мл 7,1±1,6b 178,6±49,0b

Примечание: a - достоверно по сравнению с гр. «Спонтанная» (р < 0.05)

b - достоверно по сравнению с группой «TNF 2 нг/мл» (р < 0.05)

c - достоверно по сравнению с группой «VARV-CrmB 100 нг/мл» (р < 0.05)

Таблица 2. Эффективность нейтрализации стимулирующего действия rTNF различными TNF-антагонистами (M±m).

TNF и препараты TNF-антагон. Суммарный ХЛ ответ (имп/103 МНК/30 мин) p
Без стимуляторов (0) 8,4±2,8
TNF 2 нг/мл 16,9±1,5 p2-1<0,01
AbTNF + 8 нг/мл 7,3±2,2
AbTNF 50 нг/мл 7,4±1,9
VARV-CrmB 8 нг/мл 7,8±2,2
TNF 2 нг/мл + AbTNF 8 нг/мл 12,5±2,3 p6-1<0,05
TNF 2 нг/мл + AbTNF 50 нг/мл 8,4±1,6 p7-2<0,01 p7-6<0,05
TNF 2 нг/мл + CrmB 8 нг/мл 7,3±1,8 p8-2<0,01 p8-6<0,01




Таким образом, при изучении влияния TNF-связывающего белка VARV-CrmB была продемонстрирована достаточно высокая эффективность его блокирующей способности TNF-индуцированной генерации АМК и продукции IL-1 и IL-6 МНК здоровых доноров.

Исследование противовоспалительных эффектов

VARV-CrmB в модели коллаген-индуцированного артрита.

Модель КИА была выбрана для оценки in vivo противовоспалительных эффектов белка VARV-CrmB. Результаты шкальной оценки клинического проявления КИА у мышей разных представлены в табл. 3. В динамике развития КИА (II группа) наблюдали закономерное усиление клинических проявлений артрита, которое, судя по результатам шкальной оценки, повышается вплоть до 21 суток наблюдения. Введение поли-AbTNF и VARV-CrmB, судя по показателям шкальной оценки, приводило к снижению степени активности артрита у мышей на ранних сроках наблюдения. Так, только через 2 суток после введения поли-AbTNF сумма баллов по шкале была статистически ниже, чем у мышей II группы (КИА). В то же время, у мышей IV группы (КИА+VARV-CrmB) сумма баллов была достоверно меньшей на 2 и 7 сут. Затем, к 14 и 21 суткам показатели шкальной оценки степени активности артрита во всех сравниваемых группах практически не отличались (табл. 3).

Таблица 3. Показатели шкальной оценки клинических проявлений коллаген-индуцированного артрита у мышей в динамике его развития и при введении поли-AbTNF и VARV-CrmB (M±m).

Гр. животных Сроки наблюдения, сут.
2 7 14 21
I. Контроль 0 0 0 0
II КИА 3,8±0,17 5,3±0,6 7,2±1,4 9,6±1,5
III КИА+abTNF 2,7±0,7** 4,4±0,9 6,9±0,8 9,7±1,2
IV КИА+CrmB 2,2±0,3** 3,7±0,5** 6,2±0,6 9,3±1,7


Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.