WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Влияние мезенхимальных стромальных клеток на иммунную реконституцию в посттрансплантационном периоде у больных лимфомами

-- [ Страница 2 ] --

Получение, культивирование и введение МСК. Аспират костного мозга (КМ) в объеме до 50 мл получали путём трепанобиопсии из крыла подвздошной кости или стернальной пункции. Аспират инкубировали при 370С в течение 40 мин. После гравитационного разделения лейковзвесь центрифугировали (1500 об./мин, 10 мин), осадок клеток ресуспендировали в питательной среде -MEM («БиолоТ», С-Пб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 20% FCS («БиолоТ», С-Пб, или HyClone, США).

Для генерации МСК мононуклеарные клетки (МНК) аспирата КМ культивировали в пластиковых флаконах 25, 75 или 150 см2 («Nunclon», Дания) с исходной плотностью 106 клеток/см2 в питательной среде -MEM, дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 20% FCS, при 37°C в CO2-инкубаторе. Через 24-48 ч. неприкрепленные к пластику клетки удаляли, фракцию адгезивных клеток культивировали до получения клеточного монослоя (80-90% площади культурального флакона). Обновление питательной среды проводили дважды в неделю. Отделение МСК от поверхности флакона при пассировании осуществляли с использованием 0,25% раствора трипсина (Sigma-Aldrich, США) и 0,02% раствора ЭДТА (ICN, США). Морфологию полученных клеток оценивали визуально с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Для ко-трансплантации МСК криоконсервировали в 10%-ном растворе человеческого альбумина («Микроген», Россия), содержащем 10% DMSO (Sigma-Aldrich, Германия). Размораживание клеток проводили перед введением на водяной бане при 37°C, клетки отмывали в питательной среде -MEM и в физиологическом растворе, ресуспендировали в 20 мл физиологического раствора и вводили внутривенно сразу после трансплантации ГСК. Жизнеспособность размороженных клеток во всех случаях превышала 90%.

Характеристика МСК. Для оценки соответствия генерируемых ex vivo клеток минимальным критериям МСК, определенным Международным обществом клеточной терапии (2006 г.) в отдельной серии экспериментов наряду с морфологической оценкой исследовали фенотип генерируемых клеток и их способность к мультипотентной дифференцировке. Фенотипический анализ клеток методом проточной цитометрии показал, что подавляющее большинство генерируемых клеток экспрессируют характерные для МСК стромальные антигены: CD73 (86,1 ± 5,6 %), CD90 (79,9 ± 4,9 %) и CD105 (89,2 ± 4,9 %) и не экспрессируют СD34 (6,8 ± 3,2 %), а также линейные маркеры - СD3 (4,7 ± 1,3 %), CD20 (5,5 ± 1,8 %), CD14 (9,7 ± 3,4 %). Остеогенную дифференцировку индуцировали путем 14-18-дневного культивирования МСК в индукционной среде, содержащей глицерол-2-фосфат, аскорбиновую кислоту и дексаметазон. В результате генерируемые фибробластоподобные клетки КМ дифференцировались в клетки, способные к образованию внеклеточных депозитов кальция, т.е. гистохимически соответствующие остеобластам. Адипогенную дифференцировку индуцировали путем культивирования генерируемых МСК в индукционной среде, содержащей изобутилметилксантин, дексаметазон и индометацин. Культивирование клеток в течение 14 суток в адипогенной среде приводило к появлению адипоцитоподобных клеток, содержащих в цитоплазме липидные вакуоли, которые специфически окрашивались с помощью красителя масляного красного, что свидетельствовало о способности фибробластоподобных клеток КМ дифференцироваться в клетки с цитохимическими/морфологическими свойствами адипоцитов.

Методы лабораторных исследований. У больных ЗЛ в контрольных точках (непосредственно перед ВДХТ, на день выхода из лимфопении (лимфоциты 0,5 x 109/л), через 6 и 12 мес. после АТГСК) и условно здоровых доноров забирали 10-20 мл венозной крови в пробирку с гепарином (конечная концентрация гепарина 50 ЕД/мл). Для исследования использовались лейковзвесь и МНК периферической крови (ПК), которые выделяли стандартно путём центрифугирования цельной гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина (=1,078) в течение 20 мин при 3000 об/мин с последующей двукратной отмывкой в ЗФР и полной культуральной среде (RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% сыворотки плодов коровы («БиоЛот», Санкт-Питербург). Забор крови и все иммунологические исследования проводились после получения письменного информированного согласия пациентов. Общее количество пациентов, включенных в контрольную группу, составило 219 сопоставимых по полу и возрасту условно здоровых доноров.

Определение количества лимфоцитов и диагностика раннего восстановления лимфоцитов (РВЛ). В работе использованы результаты общего анализа крови с лейкоцитарной формулой (ПК и продукта афереза) и биохимических анализов, рутинно проводимых больным. РВЛ считалось наступившим, если выход из цитопении (лейкоциты > 1 x 109/л) наступал не позднее 15 дня после АТГСК, а количество лимфоцитов в периферической крови при этом составляло 500 и более клеток/мл.

Определение субпопуляций клеток методом проточной цитометрии. Приготовление образцов для определения относительного содержания субпопуляций клеток, экспрессирующих поверхностные CD-маркеры, проводили в соответствии с методикой Becton Dickinson с модификациями. МНК (50 мкл, 0,5 х 106 клеток/пробу) в растворе «А» (5% желатиноля, 0,1% азида натрия, 0,02% ЭДТА, 10% сыворотки доноров АВ (IV) группы в ЗФР) помещали в цитометрические пробирки. К суспензии клеток добавляли рекомендуемое количество моноклональных антител, меченных PerCP, PE и FITC, инкубировали 30 мин при 40С. Затем клетки отмывали от антител раствором «В» (0,1% азида натрия, 0,02% ЭДТА в ЗФР), ресуспендировали и заливали 0,5 мл лизирующего раствора (FACSLyse, Becton Dickinson, США). Подготовленные пробы исследовали на лазерном проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CellQuest (Becton Dickinson, США). Процент позитивных клеток, экспрессирующих соответствующие CD-маркеры, определяли в лимфоцитарном гейте (минимум 30000 событий).



Для определения субпопуляции CD4+CD25high Т-клеток использовали PE-меченные анти-CD4 (ЗАО «Сорбент-сервис», г. Москва) и FITC-меченные анти- CD25 моноклональные антитела (Becton Dickinson, США), учитывая клетки с наибольшей интенсивностью свечения CD25. Для идентификации CD4+FOXP3+ Т-клеток использовали FITC-меченные анти-CD4 (ЗАО «Сорбент-сервис», г. Москва) и PE-меченные анти-FOXP3 моноклональные антитела (Becton Dickinson, США). Пермеабилизацию проводили в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре в 0,2%-ном растворе Tween-20 (Ferak, Германия). Для оценки субпопуляций наивных Т-клеток и Т-клеток памяти использовали PE- и FITC-меченные анти-CD4, анти-CD8, анти-CD45RA и анти-CD45RO моноклональные антитела (Becton Dickinson, США), для выявления CD4+CD45RA+CD31+ Т-клеток - PE-меченные анти-CD31 (eBioscience, США), PerCP-меченные анти-CD4 (Becton Dickinson, США) и FITC-меченные анти-CD45RA моноклональные антитела (Becton Dickinson, США).

Оценка влияния МСК на пролиферативную активность лимфоцитов.

МНК здоровых доноров или больных ЗЛ (105 клеток в 0,15 мл полной культуральной среды) стимулировали рекомбинантным интерлейкином-2 (IL-2) в дозе 100 ЕД/мл («Ронколейкин», ООО «Биотех») и культивировали в течение 72 ч в 96-луночных круглодонных планшетах при 37оС в СО2-инкубаторе в отсутствие или присутствии различных доз МСК (2 х 103; 104; 5 х 104; 105 клеток/лунку). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению 3Н-тимидина, вносимого за 18 ч. до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Подсчет радиоактивности материала производили в жидкостном сцинциляционном счетчике SL - 30 (Intertechnic, Франция). Оценивали спонтанную пролиферативную активность МНК, а также IL-2-стимулированную пролиферативную активность в отсутствие и присутствии МСК.

Статистическая обработка полученных результатов производилась с использованием программных пакетов Statistica 6.0 (StatSoft) и GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.). Таблицы и рисунки содержат информацию в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (М ± SE), медианы (Ме), в отдельных случаях – интерквартильного диапазона или диапазона минимальных и максимальных значений. Для оценки значимости различий дискретных переменных между группами использовали критерий 2 и точный метод Фишера. Для оценки значимости различий независимых непрерывных переменных использовали непараметрический U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, для сравнения зависимых выборок - критерий Вилкоксона для парных выборок. Для оценки взаимосвязи количественных показателей с качественными альтернативно распределенными признаками применяли коэффициент корреляции Спирмена. Для оценки диагностической значимости определяемых показателей использовали ROC-анализ с расчетом площади под кривой. С целью оценки нескольких прогностических факторов применяли метод логистической регрессии. Анализ выживаемости проведен по методу Каплана-Мейера, для оценки достоверности использован log-rank-критерий. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Чтобы оценить влияние МСК на раннее восстановление лимфоцитов (РВЛ; 0,5 х 109/л на 15-й день после АТГСК), был проведен сравнительный анализ частоты встречаемости пациентов с РВЛ в группах со стандартной (МСК-; n=92) АТГСК и ко-трансплантацией МСК (МСК+; n=75). МСК вводили в средней дозе 0,2 х 106 клеток/кг. Сравниваемые группы значимо не различались по возрасту, полу, статусу заболевания, показателям предлеченности, режимам мобилизации и кондиционирования, количеству вводимых гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и абсолютному количеству лимфоцитов в продукте сепарации (таблица 1).

Таблица 1
Характеристика больных исследуемых групп
Параметры Группы больных
МСК(-) n=92 МСК(+) n=75 Достоверность различий*
Возраст (лет), медиана (min-max) 37,5 (7-58) 33 (16-62) 0,32
Пол: - мужчины/женщины 54/38 (59/41 %) 39/36 (52/48 %) P2=0,39
Статус: - полная ремиссия - частичная ремиссия - прогрессия/резистентное течение 19 (21 %) 56 (61 %) 17 (18 %) 22 (29 %) 43 (57 %) 10 (13 %) P2=0,19 P2=0,64 P2=0,37
Режимы мобилизации: - ХТ + Г-КСФ / Г-КСФ 87 / 5 (95 / 5 %) 68 / 7 (91 / 9 %) P2=0,33
CD34+ клетки, х106/кг M ± SE (Ме) 5,81 ± 0,5 (4,44) 4,70 ± 0,3 (4,40) PU=0,33
Абсолютное количество лимфоцитов (х109) в продукте сепарации. M ± SE (Ме) 10,7±1,0 (8,99) 13,8 ± 1,6 (10,5) PU=0,22
День выхода из лейкопении (Le>1,0 x 109 /л) 16,2 ± 1,3 13,6 ± 0,3 PU=0,058
Примечания: *достоверность различий: 2 –критерий хи квадрат, U –критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.




РВЛ в группе со стандартной АТГСК наблюдалось в 56% случаев, причем эффективность РВЛ зависела от количества трансплантируемых ГСК и содержания лимфоцитов в продукте сепарации. Так, у больных, которым трансплантировали более 2,5 х 106/кг ГСК, частота РВЛ была в 2 раза выше, чем у пациентов с содержанием ГСК ниже 2,5 х 106/кг (60 против 27%, рТМФ=0,041) (рис.1А). Аналогичным образом (рис.1Б), частота РВЛ у пациентов с высоким количеством лимфоцитов в продукте сепарации в 1,7 раза превышала соответствующий показатель в подгруппе больных с низким количеством лимфоцитов (рТМФ=0,041). При этом отсутствие корреляционной взаимосвязи между количеством ГСК и лимфоцитов в продукте афереза (rs=-0,22, p=0,096) указывало, что оба параметра влияли на восстановление лимфоцитов независимо друг от друга.

Рисунок 1. РВЛ в зависимости от количества трансплантируемых ГСК (А) и абсолютного содержания лимфоцитов в продукте сепарации (Б). Ly<LQ – пациенты с низким содержанием лимфоцитов в продукте афереза (в диапазоне нижней квартили), Ly>UQ – пациенты с высоким содержанием лимфоцитов (в диапазоне верхней квартили).
 РВЛ в группах МСК(-) и МСК(+). В группе МСК(+) РВЛ-2
Рисунок 2. РВЛ в группах МСК(-) и МСК(+).


Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.