WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 |

Аутоантитела к активированным факторам свёртывания крови при ишемической болезни сердца

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Гатиятов Юрий Фаатович

Аутоантитела к активированным

факторам свёртывания крови

при ишемической болезни сердца

14.03.03 патологическая физиология

Автореферат диссертации

на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Чита – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Цыбиков Намжил Нанзатович

Официальные оппоненты:

Степанов Александр Валентинович - доктор медицинских наук, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ, заведующий кафедрой безопасности жизнедеятельности и медицины катастроф

Герасимов Александр Александрович - кандидат медицинских наук, ГУЗ «Городская клиническая больница №1» г. Читы, заведующий клинико-диагностической лабораторией

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г. Барнаул

Защита состоится « » декабря 2012 года в____часов на заседании диссертационного совета Д208.118.01 при ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ (адрес: 672090, г. Чита, ул. Горького, 39а).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ (адрес: 672090, г. Чита, ул. Горького, 39а).

Автореферат разослан «____» ноября 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

Д 208. 118. 01

д.м.н., профессор И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1

Актуальность проблемы. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) – актуальная социально-медицинская проблема и ведущая причина смертности населения многих стран, в том числе России. По данным исследований, проведённых в РФ среди мужчин 35-65 лет, смертность от ИБС в общей структуре смертности от сердечно-сосудистой патологии составляет 56,5%, а у женщин такого же возраста – 40,4%. ИБС является основной причиной (70-80%) внезапной смерти (Палкин М.Н., 2011; Панченко Е.П., 2009). Ишемическая болезнь сердца как патологический процесс представляет собой не только прогрессирующее атеросклеротическое поражение коронарного русла, но и выраженные изменения в системе гемостаза (Авалиани В.М. с соавт., 2005; Антелава Н.А. с соавт., 2005; Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002). Ключевым событием в патогенезе инфаркта миокарда является внутрикоронарный тромбоз с активацией сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, плазменных прокоагулянтов на фоне снижения активности системы фибринолиза и физиологических антикоагулянтов (Баркаган З.С. с соавт., 2004; Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002). Исходя из концепции иммунной регуляции системы гемостаза (Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., 1981), актуальным представляется изучение содержания аутоантител (ААТ) к факторам свёртывания крови (ФСК) при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, так как, с одной стороны, некроз миокарда и эндотелия при ИБС приводит к гиперпродукции тканевого фактора и появлению активированных факторов свертывания крови, с другой стороны, не исключено, что активность последних может изменяться соответствующими аутоантителами. Актуальность проблемы взаимодействия аутоантител с факторами свёртывания крови при ИБС определяется недостаточной изученностью этой проблемы, а также высокой частотой тромботических осложнений в первые месяцы после перенесённого инфаркта миокарда (Фрид М., Грайнс С., 1996). В настоящий момент не вызывает сомнения факт наличия антител к факторам свёртывания крови как в норме, так и в патологии (Petrelli C.T. et al., 2008). Известно об участии этих молекул в регуляции системы гемостаза, однако отсутствуют чёткие клинико-патофизиологические данные, характеризующие эти взаимодействия (Shoenfeld Y., Isenberg D.A. 1993; Petrelli C.T. et al., 2008). Имеются немногочисленные работы, посвящённые вопросам выяснения роли аутоантител к факторам свёртывания крови при патологических состояниях (Banninger H. et al., 1993; Franchini M. et al., 2007). Сведения о динамике аутоантител к факторам свёртывания крови при ИБС практически отсутствуют в литературе.

С открытием аутоантител с ферментативной активностью (абзимов) вопрос о роли иммунной системы по отношению к организму приобретает новые аспекты изучения (Генералов И.И. с соавт., 2009), особенно по отношению к регуляции гомеостаза (Цыбиков Н.Н., Кузник Б.И., 2005). Всё вышеуказанное позволило сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования изучить содержание аутоантител и аутоантител-абзимов к факторам свёртывания крови у больных с инфарктом миокарда и постинфарктным кардиосклерозом.

3адачи исследования:



  1. Определить концентрацию отдельных факторов свертывания крови у больных с инфарктом миокарда и постинфарктным кардиосклерозом.
  2. Установить содержание аутоантител к активированным и неактивированным факторам свёртывания крови у больных в различные стадии инфаркта миокарда и постинфарктным кардиосклерозом.
  3. Определить пул аутоантител с протеолитическими свойствами и охарактеризовать его абзимную активность.

Научная новизна. Показано, что концентрация отдельных факторов свёртывания крови в виде проферментов и ферментов изменяется в соответствии с динамикой уровня аутоантител. Установлены концентрации аутоантител IgG и IgM классов к протромбину, тромбину, VIIa, IX, IXa, X, Xa факторам, к -, - и -тромбину у здоровых и больных в острую, подострую стадии ИМ, а также при постинфарктном кардиосклерозе.

Обнаружено, что острая стадия инфаркта миокарда характеризуется снижением уровней аутоантител против IX, X факторов, - и -тромбина; увеличением аутоантител к VIIa фактору и -тромбину.

Доказано, что часть аутоантител IgG класса, направленных к тромбину и его дериватам, содержит аутоантитела, обладающие абзимной активностью. В -фракциях крови от здоровых и больных в разные стадии инфаркта миокарда и с постинфарктным кардиосклерозом содержатся аутоантитела IgG класса, обладающие протеолитическими свойствами. Впервые дана динамика абзимной активности аутоантител к вышеприведённым факторам свёртывания крови в острую, подострую стадии инфаркта миокарда и при постинфарктном кардиосклерозе.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы определятся тем, что выявленная динамика аутоантител во взаимосвязи с соответствующими факторами свёртывания крови обеспечивает более глубокое понимание патогенетических механизмов, действующих при разных стадиях инфаркта миокарда. Полученные данные позволяют взглянуть на тромботические и тромбоэмболические осложнения, развивающиеся при данной патологии, с иммунологических позиций. Динамика антитромбиновых аутоантител с абзимной активностью открывает перспективы исследований патогенеза коагулопатий.

Практическая значимость работы заключается в расширении диагностических возможностей, так как полученные знания могут быть использованы для установления с иммунологических позиций глубины нарушения системы гемостаза при ишемической болезни сердца иммунологическими методами.

Внедрение результатов. Материалы и результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах патологической физиологии и госпитальной терапии ГБОУ ВПО Читинской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования представлены на Российском национальном конгрессе кардиологов, Москва, 2012; на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2012; на Съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 2012; на Всероссийской Байкальской научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицины», Иркутск, 2012.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах. Текстовая часть состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 172 источника, из них 92 работы отечественных и 80 – зарубежных исследователей; иллюстрирована 10 таблицами, 2 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При инфаркте миокарда наиболее выраженные изменения концентрации факторов свертывания крови отмечаются в подострую стадию и в период постинфарктного кардиосклероза. У этих больных уровень тромбина повышается в 2-2,5 раза, а содержание активных и неактивных форм IX и Х факторов снижается.

2. В острую стадию инфаркта миокарда происходит снижение концентрации аутоантител к протромбину, тромбину, - и -тромбину, IX и X факторам. А к -тромбину резко повышается. При постинфарктном кардиосклерозе уровень перечисленных аутоантител восстанавливается до исходного. У всех больных, перенёсших инфаркт миокарда, определяется повышенное содержание аутоантител к VIIa фактору.

3. В препарированной -фракции белков крови здоровых и больных выявляется абзимная активность, которой обладают аутоантитела к тромбину. В острую и подострую стадии инфаркта миокарда, а также при постинфарктном кардиосклерозе абзимная активность пула аутоантител к тромбину снижается.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе представлены результаты обследования 57 больных, страдающих ишемической болезнью сердца, перенёсших инфаркт миокарда. Возраст обследуемых составлял 56,7±6,1 лет, из них 43 мужчины (75,4%), 14 женщин (24,6%). Пациенты были разделены на три группы согласно МКБ-Х: 1-я – больные с инфарктом миокарда в острую стадию (1-7 сутки, 18 человек); 2-я – пациенты с ИМ в подострую стадию (8-28 сутки, 25 человек), 3-я – пациенты с постинфарктным кардиосклерозом (ПИКС) (14 человек). На момент взятия крови все пациенты принимали медикаментозную терапию. В 1-й и 2-й группах всем больным было проведено или проводилось лечение гепарином. Ацетилсалициловую кислоту принимали все пациенты, участвовавшие в исследовании. Клопидогрел был назначен 78% больных из 1-й группы, 68% из 2-й и 21% из 3-й групп. 96,5 % обследуемых принимали селективные -блокаторы (метопролола сукцинат, бисопролол, метопролола тартрат).





Группа контроля состояла из 23 практически здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту с больными без клинических проявлений ИБС (61,1% мужчин и 38,9% женщин).

Работа проводилась с учетом Хельсинской декларации; Конвенции Совета Европы «О правах человека и биомедицине» (1996); Национального стандарта РФ «Надлежащая клиническая практика» (ГОСТ Р 52379-2005). Все пациенты дали информированное согласие на проведение исследований. Подбор больных, общеклинические исследования и получение крови проводились на базе НУЗ Дорожной клинической больницы на ст. Чита-2, ГУЗ Краевой клинической больницы №1 (Забайкальский края, г. Чита), ГУЗ Городской клинической больницы №1 г. Читы. Лабораторные исследования проведены в лаборатории экспериментальной и клинической биохимии и иммунологии НИИ медицинской экологии ГБОУ ВПО Читинской государственной медицинской академии с 2011 по 2012 годы.

Содержание протромбина, тромбина, IX/IXа, X/Xа факторов изучалось в сыворотке и плазме крови с использованием наборов для иммуноферментного анализа (AssayMax Human Prothrombin ELISA Kit, Assaypro США; AssayMax Human Thrombin ELISA Kit, Assaypro США; AssayMax Human Factor IX (FIX) ELISA Kit, Assaypro США и AssayMax Human Factor X (FX) ELISA Kit, Assaypro США).

Определение общего содержания аутоантител IgG и IgM классов к протромбину и тромбину проводили в плазме крови с помощью наборов для иммуноферментного анализа (Anti-Prothrombin IgG/IgM Orgentic Diagnostica GmbH, Германия и AESKULA Thrombin-GM, Германия).

Определение общего содержания аутоантител IgG и IgM классов к -тромбину, -тромбину, -тромбину, VIIa, VIII/VIIIa, IX, IXa, X, Xa факторам в плазме крови осуществлялось по оригинальной методике Цыбикова Н.Н., 2008.

Изучение абзимной активности. Для исследования абзимной активности из плазмы крови была предварительно получена -фракция. Для этого плазму после размораживания перемешивали на шейкере и очищали от белков крови человека ультрацентрифугированием в целлюлозном мембранном фильтре 100 кДа (Amicon Ultra 0.5mL 100K, Millipore, Ирландия) (Цыбиков Н.Н., 2011). Далее определение абзимной активности -фракции проводили спектрофотометрически при длине волны 405 нм по оценке образования 4-нитроанилина из хромогенного субстрата – БАПНА (натрий-бензоил-DL-аргинин-4(р)-нитроанилида гидрохлорида) по методике Окулича В.К., Косинца А.Н. с соавт., 2002.

Определение абзимной активности аутоантител IgG класса к тромбину. Выделение аутоантител класса IgG к тромбину из плазмы крови осуществлялось в несколько этапов. Первый этап – выделение фракции гамма-глобулинов проводили с помощью ультрафильтров фирмы Millipore (Amicon Ultra 0,5 мл, 100K, Millipore, Ирландия). В ячейку-концентратор объемом 0,5 мл вносили биоматериал и центрифугировали при 14000 g в течение 30 мин. Затем проводили аффинную хроматографию полученного материала на сефарозе 4B («GE Healthcare», Швеция), конъюгированной с тромбином человека («Roche», Германия). Тромбин человека в количестве 10 мг иммобилизовали на CNBr-активированную сефарозу 4В («GE Healthcare», Швеция), согласно методическим рекомендациям фирмы «GE Healthcare». Хроматографическую колонку последовательно отмывали 0,01 М фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 1% раствор твина 20, и 0,01 М фосфатным буферным раствором с рН 7,4 без детергента до полного исчезновения поглощения белка в элюенте при 280 нм. Элюирование связавшихся ААТ к тромбину проводили 0,1 М глицин-НСl буфером, рН 2,8, которое контролировали по выходу белка при 280 нм в элюенте. Полученные иммуноглобулины концентрировали с помощью ультрафильтров фирмы Millipore (Amicon Ultra 0,5 мл, 100K, Millipore, Ирландия). На следующем этапе проводили выделение и очистку ААТ класса IgG к тромбину. Полученный концентрат иммуноглобулинов наносили на колонку HiTrap Protein G HP (GE Healthcare, Швеция) (1 мл), уравновешенную буфером А (50 мМ Тris-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl). Иммуноглобулины, не взаимодействующие с сорбентом, отмывали тем же буфером до полного исчезновения поглощения при 280 нм. Неспецифически адсорбированные белки и липиды элюировали буфером, содержавшим 1%-ный Triton X-100. Колонку промывали 50 мМ Тris-HCl-буфером, pH 7,5, содержавшим 0,3 М NaCl. ААТ, представляющие только IgG, элюировали 0,1 М глицин-HCl, pH 2,6, и сразу после выхода с колонки фракции ААТ нейтрализовали 1,5 М Тris-HCl, рН 8,0. Диализ ААТ осуществляли на колонке HiTrap Desalting («GE Healthcare», Швеция) (5 мл) против фосфатно-солевого буфера (140 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1.8 мМ KH2PO4, pH 7.4). Полученные ААТ сразу после диализа замораживали при -200С до момента определения абзимной активности и концентрации IgG. Определение концентрации полученных аутоантител класса IgG к тромбину проводили с помощью высокоэффективной гель-фильтрации на колонке BioSep-SEC-S 2000 300x7.8 мм («Phenomenex», США), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, содержавшим 0,3 М KCl. Перед гель-фильтрацией для диссоциации комплексов 20 мкл раствора ААТ смешивали с 80 мкл 3 М MgCl2 и 150 мкл 3 М NaCl, выдерживали 30 мин, центрифугировали (10 мин, 10 000 g). Перед нанесением образца на колонку вводили 20 мкл буфера, содержавшего 0,5 М MgCl2 и 1 М NaCl, а затем – раствор ААТ в количестве 20 мкл. Скорость потока элюента – 1 мл/мин., длина волны детекции – 215 нм. Определение абзимной активности аутоантител IgG класса к тромбину осуществляли по методике Окулича В.К., Косинца А.Н. с соавт., 2002.



Pages:   || 2 | 3 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.