WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Аутоантитела к фактору некроза опухоли при ревматоидном артрите и бронхиальной астме

-- [ Страница 2 ] --

Для проведения хроматографии использовались следующие буферные растворы: рабочий буферный раствор – 20 mM PBS (pH=7,4), буферный раствор для удаления неспецифически связавшихся компонентов – 1М гуанидин-HСl (pH=7,4), буферный раствор для элюции – 0,1 М Gly-HСl (pH=2,5). Объем сорбента в колонке составил 1,5 мл, объем вносимой пробы – 3 мл, скорость потока – 0,4 мл/мин. При проведении элюции полученную фракцию нейтрализовали титрованием 1М Тris-НСl буферным раствором (рН 9,0) до физиологических значений рН. Выделенные фракции антител объединяли и диализовали при +4°С против не менее чем 100-кратного по объему 20 mM PBS (pH=7,4) в течении 12 часов.

Магнитная сепарация

Для магнитной сепарации [Темежникова Н.Д., 2001; Bangs L.B., 1996; Peraski A.H., 2003] использовали магнитные частицы (Dynabeads М-280, Dynal Biotech, Норвегия), покрытые стрептавидином, и кроличьи поликлональные антитела к ТNF, которые предварительно метили биотином (ORIGEN, США).

Определение количественного содержания TNF электрохеми-люминесцентным методом

В проведенной работе использовались меченные TAG поликлональные антитела

к TNF (R&D Systems, Великобритания), а также рекомбинантный человеческий TNF (R&D System, Великобритания) для создания калибровочного стандарта. Подготовку реактивов и определение каждого цитокина проводили, как описано ранее [Sennikov S.V., 2003].

Электрофоретический анализ белков проводили по методу Лэммли [Laemmli U.K., 1970] в присутствии 2-меркаптоэтанола.

Иммуноферментный анализ

Определение содержания подклассов IgG, TNF и растворимых рецепторов к ТNF I и II типов проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем.

Определение сывороточного содержания аутоантител к TNF проводили методом твердофазного ИФА [Вербов В.Н., 1998; Sioud M., 1994]. Относительное содержание антител классов IgG, IgA и IgM и подклассов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 определяли с использованием набора для проведения ИФА, включающего рекомбинантный человеческий ТNF (ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Россия), реактивы фирмы Иммунотех (Россия): фосфатно-солевой буферный раствор, 1-компонентный раствор ТМБ и стоп-раствор, а также моноклональные антитела к классам и субклассам иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена фирмы «Полигност» (Россия). В качестве калибровочного материала для определения содержания аутоантител подклассов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 использовалась полученная с помощью методов аффинной хроматографии фракция аутоантител к TNF, выделенная из сыворотки крови условно здоровых доноров. Предварительно в очищенной фракции методом ИФА было измерено содержание подклассов IgG.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы «Statistica 7.0». Проверка выборки на нормальность распределения проводилась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Данные представлялись в виде среднего и ошибки среднего, а также в виде медианы и диапазона значений квартилей (25% и 75%). Для проверки гипотез о достоверности различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни и критерий знаков. В пояснениях к иллюстрациям количество лиц в группе обозначено n.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Показано, что при патологических состояниях аутоиммунной и аллергической этиологии, а именно при РА и БА, наблюдаются выраженные воспалительные реакции, ключевым медиатором которых является TNF [Berry M., 2007; Butler D.M., 1995; Rho Y.H., 2009; Thomas P.S., 1996].

В нашей работе методом твердофазного ИФА с использованием коммерческих тест-систем была проведена оценка содержания TNF (рис. 1).

Было показано, что содержание TNF в сыворотках крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, и больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением достоверно выше такового в сыворотках крови условно здоровых доноров, а также достоверное снижение уровня TNF при ответе на терапию больных РА и при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению БА, что подтверждает активное участие данного цитокина в патогенезе исследуемых заболеваний.

Одним из путей регуляции биологической активности TNF в организме человека служат растворимые рецепторы к цитокину двух типов, и в нашей работе методом ИФА с использованием коммерческих наборов были измерены уровни sTNFRI и sTNFRII (табл. 1). Было показало преобладание содержания рецептора II типа по сравнению с содержанием рецептора I типа во всех исследованных группах, что согласуется с литературными данными [Robak T., 1998]. Также было определено, что содержание рецепторов к TNF обоих типов в сыворотках крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, и больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением достоверно выше по сравнению с условно здоровыми донорами, что говорит об активном вовлечении растворимых рецепторов к TNF в протекание патологических процессов при РА и БА [Robak T., 1998; Yoshida S., 1996].

Еще одним из факторов, способных регулировать активность иммуномодулирующих молекул в организме, являются аутоантитела. На настоящий момент в литературе имеется небольшое количество работ, посвященных исследованию аутоантител к фактору некроза опухоли. Так аутоантитела к TNF были обнаружены в сыворотках крови здоровых доноров, пациентов с грамотрицательной бактериальной септицемией, кистозным фиброзом, хронической легочной инфекцией, а также с различными ревматическими заболеваниями, в том числе с РА [Fomsgaard A., 1989; Sioud M., 1994].

В данной работе с помощью метода ИФА было измерено относительное содержание аутоантител классов IgA, IgM и IgG к TNF (табл. 2). Для определения относительных значений использовали условные единицы оптической плотности.

Таблица 1.

Содержание sTNFRI и sTNFRII в сыворотке крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением и условно здоровых доноров.

Группа sTNFRI (пг/мл) sTNFRII (пг/мл)
Больные РА в стадии обострения 1407,9* (1217,92187,4) 2999,0*# (2543,03702,1)
Больные РА, ответившие на терапию 1386,5* (1122,71837,6) 2795,4*# (2635,33198,2)
Больные БА с неконтролируемым течением 909,3* (728,71533,8) 2851,6*# (2650,92972,0)
Больные БА с контролируемым течением 1052,3* (816,61481,6) 2688,2*# (2650,93051,8)
Условно здоровые доноры 92,7 (24,4–212,8) 1710,3 # (1068,22209,2)


Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала. Достоверность различий определена с помощью критерия Манна-Уитни. * - достоверно (p<0,05) по сравнению с условно здоровыми донорами; # - достоверно (p<0,05) по сравнению с содержанием sTNFRI.

Таблица 2.

Относительное содержание аутоантител к TNF классов IgA, IgM и IgG в сыворотке крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением и условно здоровых доноров.

Группа IgG IgA IgM
Больные РА в стадии обострения (n=12) 1,687 (1,562– 2,136) 0,473 (0,337– 0,577) 1,496 (1,331–1,752)
Больные РА, ответившие на терапию (n=12) 1,787 (1,266– 2,412) 0,415 (0,247– 0,514) 1,555 (1,388–1,667)
Больные БА с неконтролируемым течением (n=7) 1,642 (1,505– 2,014) 0,634 (0,425– 0,744) 1,305 (1,206– 1,725)
Больные БА с контролируемым течением (n=7) 1,432 (1,396– 1,760) 0,488 (0,436– 0,554) 1,327 (1,320– 1,445)
Условно здоровые доноры (n=12) 1,592 (1,275– 2,327) 0,491 (0,396–0,641) 1,364 (1,292–1,553)




Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала и выражены в единицах оптической плотности.

Аутоантитела к TNF классов IgA, IgG, IgM и подклассов иммуноглобулина G были обнаружены во всех исследованных группах. Значимых достоверных отличий в относительном содержании измеренных классов аутоантител между исследованными группами не было показано, при этом были найдены достоверные отличия в относительном содержании подклассов IgG (табл. 3).

Таблица 3.

Относительное содержание подклассов иммуноглобулина класса G аутоантител к TNF в сыворотке крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с контролируемым и неконтролируемым течением и условно здоровых доноров.

Группа IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Больные РА в стадии обострения 0,057 (0,049–0,066) (n=17) 0,090 * (0,0660,124) (n=16) 0,107 * (0,0780,148) (n=16) 0,063 * (0,0400,089) (n=13)
Больные РА, ответившие на терапию 0,057 (0,051–0,069) (n=13) 0,072 # (0,0510,091) (n=12) 0,089 (0,071–0,119) (n=11) 0,036 # (0,0290,055) (n=10)
Больные БА с неконтроли-руемым течением 0,054 (0,050–0,059) (n=12) 0,096 * (0,0900,168) (n=11) 0,114 * (0,0850,155) (n=13) 0,056 * (0,0470,075) (n=10)
Больные БА с контролируе-мым течением 0,069 (0,062–0,092) (n=8) 0,074 $ (0,0560,104) (n=10) 0,087 (0,084–0,091) (n=9) 0,043 $ (0,0390,047) (n=9)
Условно здоровые доноры 0,057 (0,048–0,063) (n=18) 0,074 (0,055–0,081) (n=14) 0,081 (0,064–0,102) (n=15) 0,034 (0,028–0,055) (n=16)


Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.