WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Аутоантитела к фактору некроза опухоли при ревматоидном артрите и бронхиальной астме

-- [ Страница 3 ] --

Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала и выражены в единицах оптической плотности. Достоверность различий определена с помощью критерия Манна-Уитни. * - достоверно (p<0,05) по сравнению с условно здоровыми донорами; # - достоверно (p<0,05) по сравнению с больными РА в стадии обострения; $ - достоверно (p<0,05) по сравнению с больными БА с неконтролируемым течением.

Было показано достоверное повышение относительного содержания подклассов IgG2, IgG3 и IgG4 в сыворотках крови больных РА в стадии обострения и больных БА с неконтролируемым течением по сравнению с условно здоровыми донорами. При этом относительное содержание подклассов IgG2 и IgG4 достоверно понижалось при ответе на терапию у больных РА и при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению БА, что может указывать на участие аутоантител к TNF подклассов IgG2, IgG3, IgG4, и в особенности IgG2 и IgG4, в патогенезе рассматриваемых патологий.

На сегодняшний день в большинстве работ по изучению роли аутоантител к цитокинам их содержание выражают в относительных единицах. Так, например, при использовании ИФА с применением меченых антител результаты получают в единицах оптической плотности, которые зависят от активностей каждого из применяемых ферментов и характеристик приборов, используемых разными исследовательскими группами [Meager A., 1999, 2003; Puel A., 2010]. Однако такой подход создает трудности при сравнении данных, полученных различными группами исследователей, вследствие использования различных реагентов и методов для определения аутоантител и делает невозможным сравнение содержания аутоантител различных классов и подклассов в пределах каждой исследуемой группы. В связи с этим в нашей работе методом ИФА были определены абсолютные количества аутоантител к TNF с использованием в качестве калибровочного материала чистой фракции аутоантител к TNF, полученной из сыворотки крови условно здоровых доноров.

Для получения чистой фракции аутоантител к TNF из сыворотки крови человека был разработан протокол, включающий комплекс хроматографических процедур с использованием колонок с сорбентами BioGel P6 DG (BioRad, США), Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, США) и Affi-Gel 15 (BioRad, США), и процедуру магнитной сепарации с использованием магнитных бус (Dynal Biotech, Норвегия) и кроличьих поликлональных антител к ТNF, меченых биотином.

Согласно разработанному протоколу получения чистой фракции аутоантител к TNF, на первом этапе выделения был осуществлен перенос сыворотки в соответствующий буферный раствор, необходимый для дальнейших процедур аффинной очистки антител, с помощью колонки с Вio-Gеl Р6 DG сорбентом (рис. 2).

Высокомолекулярные фракции, собранные с колонки с сорбентом Вio-Gеl Р6 DG, были нанесены на колонку с Рrotein G Sерharose Fast Flow аффинным сорбентом (рис. 3). Использование колонки с сорбентом Protein G позволило выделить аутоантитела класса IgG всех четырех подклассов, что может быть весьма существенно, поскольку большинство ауантител к цитокинам относятся к классу высокоаффинных IgG [Watanabe M., 2010].

Для выделения специфических аутоантител к TNF в предложенном протоколе выделения был использован предварительно связанный с цитокином сорбент Affi-Gel 15 (рис. 4). Выбор сорбента был обусловлен его способностью быстро и с высокой степенью эффективности связывать все лиганды, имеющие первичные аминогруппы, и лиганды с низким молекулярным весом, а также соответствием изоэлектрической точки TNF (pI=5,3) параметрам эффективного связывания белка с сорбентом [Dorin G., 1990]. Ранее в ряде работ была показана эффективность данного сорбента для проведения аффинной хроматографии [Thevananther S., 1999; West I., 1994].

Полученная после осуществления всего комплекса процедур аффинной хроматографии фракция аутоантител к TNF, как было показано в результате проведения предварительного опыта, содержала примесь самого цитокина, которая при проведении последнего хроматографического этапа выделения неизбежно в небольшом количестве смывается с колонки. В связи с этим было принято решение об использовании дополнительной стадии, в качестве которой была выбрана процедура магнитной сепарации, что было обусловлено возможностью проведения эффективной очистки фракции аутоантител благодаря высокоаффинному связыванию биотина, конъюгированного с кроличьими поликлональными антителами к TNF, и стрептавидина, которым покрыты магнитные бусы. Выбранная процедура очистки делает возможным удаление не только свободного TNF, но и связанного с аутоантителами, что подтверждается применением метода электрохемилюминесценции для определения оставшегося в растворе TNF.

Согласно полученным данным, до проведения процедуры магнитной сепарации на 100000 пг белка (концентрация белка была определена с помощью системы NanoDrop 2000с) содержание примеси составило 82,8 пг, после проведения магнитной сепарации примесь TNF во фракции аутоантител к TNF отсутствовала.

После проведения магнитной сепарации чистота полученных фракций была дополнительно подтверждена с использованием методов ИФА и электрофореза белков по Леммли, также с помощью метода электрофореза белков по Леммли было подтверждено соответствие по молекулярному весу иммуноглобулинам класса G (рис. 5).



На основании проделанной работы подана заявка на патент «Способ аффинного выделения аутоантител класса IgG к иммунорегуляторному цитокину TNF».

Получение фракции аутоантител к TNF, содержащей все четыре подкласса IgG, и отсутствие в ней примеси самого медиатора дает возможность проведения иммуноферментного анализа для определения абсолютного содержания аутоантител к TNF в сыворотках крови человека с использованием в качестве калибровочных образцов полученных фракций аутоантител к TNF, поскольку отсутствует конкуренция сорбированного в лунках планшета TNF с растворимым медиатором.

Таблица 4.

Содержание подклассов IgG аутоантител к TNF в сыворотке крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением и условно здоровых доноров.

Группа IgG1 (нг/мл) IgG2 (нг/мл) IgG3 (нг/мл) IgG4 (нг/мл)
Больные РА в стадии обострения 176,100 (138,500–218,400) (n=17) 78,675 * (53,555114,775) (n=16) 161,955 * (116,900227,545) (n=16) 74,180 * (44,910107,270) (n=13)
Больные РА, ответившие на терапию 176,100 (147,900–232,500) (n=13) 60,355 # (37,86080,240) (n=12) 134,290 (105,840–181,710) (n=11) 39,820 # (30,91064,000) (n=10)
Больные БА с неконтроли-руемым течением 162,000 (143,200–185,500) (n=12) 85,470 * (79,190160,820) (n=11) 173,810 * (127,970238,610) (n=13) 64,635 * (53,82089,450) (n=10)
Больные БА с контролируе-мым течением 232,500 * $ (199,600340,600) (n=8) 62,450 $ (43,62093,850) (n=10) 131,130 (126,390–137,450) (n=9) 48,730 $ (43,64053,820) (n=9)
Условно здоровые доноры 176,100 (133,800–204,300) (n=18) 62,450 (42,570–69,780) (n=14) 121,650 (94,770–154,840) (n=15) 36,635 (29,000–63,360) (n=16)


Pages:     | 1 | 2 || 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.