WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Особенности распределения длины теломер на отдельных хромосомах в лимфоцитах в норме и при иммунопатологических заболеваниях

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЗИННАТОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

Особенности распределения длины теломер на отдельных хромосомах в лимфоцитах в норме и при иммунопатологических заболеваниях

14.03.09 – «Клиническая иммунология, аллергология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Новосибирск 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН Козлов Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Климов Владимир Васильевич

доктор биологических наук Жданова Наталья Сергеевна

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России

Защита состоится « » 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в ФГБУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «___» _______________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Прогностическим фактором благополучного старения является сохранение структурной целостности и функциональной активности организма [Goronzy J., 2006]. Природа обладает значительными ресурсами для восстановления любых частей в сложном многоклеточном организме, благополучие и долголетие которого определяется сбалансированными процессами, необходимыми для его работы и восстановления в соответствии с функциональными потребностями. На клеточном уровне существует несколько механизмов, которые предотвращают и репарируют повреждения. Их основное назначение - сохранение и восстановление, в случае необходимости, целостности генома [Hasty P., 2003]. Отличительной характеристикой генома эукариот является наличие линейных хромосом. В связи с этим появляется ряд особенностей, связанных в основном с репликацией ДНК, способных привести, в конечном счете, к повреждению кодирующей части генома вследствие проблем концевой недорепликации [Calado R., 2009, Blasco M., 2007, Olovnikov A., 1971]. С целью предотвращения потери кодирующих последовательностей генома при каждом раунде репликации и предупреждения значительных хромосомных реаранжировок, линейные хромосомы заканчиваются повторяющимися нуклеопротеиновыми структурами, называемыми теломерами [Palm W., 2008]. Каждое клеточное деление сопровождается прогрессивным укорочением теломер, которое, достигая определённого порогового уровня, приводит к нестабильности генома, старению и апоптозу клетки. Укорочение теломер, механизмы поддержания и восстановления их длины занимают центральное место в определении дальнейшей судьбы клеток.

Иммунная система чрезвычайно чувствительна к возрастным изменениям в организме, вследствие того, что основная роль клеток иммунной системы сводится к адаптивному ответу на иммунные стимулы массивной пролиферацией с последующим сокращением образовавшегося клона клеток [Goronzy J., 2003]. Клетки иммунной системы должны быть способны к экспоненциальному количественному увеличению собственной популяции и к запрограммированной смерти, когда организм в них долго не нуждается. Это, в конечном счете, приводит к пролиферативному стрессу и укорочению теломер в лимфоцитах. Следовательно, иммунный ответ в пожилом возрасте, также как и возрастзависимая иммунопатология, в значительной степени определяются процессами регенерации клеток иммунной системы или их недостатком [Andrews N., 2010]. Тем не менее, в отличие от соматических клеток, которые имеют ограниченную продолжительность жизни и лимитированные возможности для пролиферации, лимфоциты способны поддерживать длину теломер за счет экспрессии фермента теломеразы, что пролонгирует их жизнь и увеличивает пролиферативные способности [Shay J., 2005]. Таким образом, динамика изменения длины теломер является одним из ключевых факторов в обеспечении работы иммунной системы, что определяет актуальность ее изучения при старении иммунной системы и иммунопатологических заболеваниях.

Рядом предшествующих работ была исследована средняя длина теломер в популяции Т-лимфоцитов, моноцитах и гранулоцитах при аутоиммунной патологии и атопии [Борисов В.И., 2007, Goronzy J. 2006]. Доказано, что при ревматоидном артрите (РА), атопическом дерматите (АД) и бронхиальной астме (БА) происходит укорочение средней длины теломер в перечисленных клеточных популяциях. Известно, что В-лимфоциты принимают активное участие в иммунопатогенезе представленных выше заболеваний за счет различных механизмов: презентация антигенов Т-лимфоцитам (особенно в позднюю стадию иммунного ответа), синтез аутоантител и цитокинов [Kim H., 2000]. Исследование средней длины теломер в В-лимфоцитах, таким образом, представляет значительный интерес, поскольку может дополнить патогенетическую картину исследуемых заболеваний и оценить пролиферативный статус В-лимфоцитов.



Известно, что теломеры характеризуются хромосомспецифическим распределением длины, причем разница между длиной теломер двух гомологичных хромосом (отцовской и материнской) может достигать до 6,5 т.п.н. [Baird D., 2003]. Подобное распределение определяет вариабельность средней длины теломер. Исследование данного параметра в лимфоцитах в норме и при иммунопатологии, таким образом, позволит оценить гетерогенность исследуемой популяции клеток по длине теломер и предположить наличие критически укороченных теломер.

До недавнего времени исследования динамики изменения длины теломер при старении и иммунопатологии фокусировались в основном на измерении средней длины теломер [Борисов В.И., 2007, Goronzy J., 2006]. Тем не менее, известно, что присутствие критически укороченных «сигнальных» теломер в клетке, а не средняя длина теломер, определяет судьбу клетки [Gilson E., 2007, Verdun R., 2007, Hemann M., 2001]. Критически укороченные теломеры первыми будут подвергаться слиянию конец-в-конец, приводить к нарушению целостности генома и последующей гибели клетки через апоптоз [Hemann M., 2001]. Исследованию индивидуального теломерного профиля (то есть распределению теломер на отдельных хромосомах) на сегодняшний момент посвящено ограниченное количество исследовательских работ. Имеющиеся данные касаются идентификации укороченных теломер на определённых хромосомах при онкопатологии и предраковых заболеваниях. Это, в свою очередь, помогает определить прогноз течения заболевания [Xing J., 2009, Finley J., 2006]. Представляется перспективным, таким образом, исследовать особенности распределения длины теломер на отдельных хромосомах в норме и при иммунопатологии, что позволит детализировать особенности укорочения теломер на уровне отдельных хромосом и предположить этиологическую значимость выявленных изменений.

Цель исследования. Исследовать длину теломер лимфоцитов на уровне показателей средней длины всех теломер и относительной длины теломер отдельных хромосом в норме и при иммунопатологических заболеваниях.

Задачи исследования:

  1. Исследовать среднюю длину теломер в В- и Т-лимфоцитах в норме и при ревматоидном артрите, атопическом дерматите, бронхиальной астме.
  2. Оценить вариабельность средней длины теломер в лимфоцитах в норме и при иммунопатологических заболеваниях.
  3. Исследовать гетерогенность распределения длины теломер на отдельных хромосомах в Т-клетках периферической крови у здоровых индивидуумов, а также у пациентов с ревматоидным артритом и атопическим дерматитом.

Научная новизна. Впервые выявлено укорочение средней длины теломер в В-лимфоцитах у пациентов с ревматоидным артритом, атопическим дерматитом и бронхиальной астмой (инфекционно-зависимой и смешанной формах).

Определена вариабельность средней длины теломер в субпопуляциях лимфоцитов в норме и при патологии: при РА и атопической форме БА вариабельность средней длины теломер увеличивается в CD4+, CD8+ и CD19+ лимфоцитах, при АД и смешанной форме БА - только в CD4+ и CD19+ лимфоцитах.

Впервые определены особенности укорочения относительной длины теломер на отдельных хромосомах при аутоиммунной патологии и атопии. При атопическом дерматите в сравнении с донорами теломеры укорачиваются на 1q, 10p, 17p хромосомах, при ревматоидном артрите – на 4p хромосоме. Укорочение относительной длины теломер на отдельных хромосомах не сопровождается изменением основных особенностей хромосомспецифического распределения длины теломер в сравнении с донорами.

Научно-практическая значимость работы Идентификация укороченных теломер на определенных хромосомах при иммунопатологии открывает перспективы поиска дополнительных факторов развития ревматоидного артрита и атопического дерматита (возможность модификации уровня активности генов, расположенных в субтеломерных районах ДНК, в результате укорочения теломер).

Положение, выносимое на защиту

Укорочение теломер на индивидуальных хромосомах при иммунопатологических заболеваниях (ревматоидном артрите и атопическом дерматите) является характерной особенностью последних и характеризуется вовлечением теломер разных хромосом.

Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 8-ой отчетной конференции ГУ НИИ КИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (г. Новосибирск, 2011). Апробация диссертации состоялась 16 февраля 2012г. на семинаре ФГБУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 120 страницах машинописного текста, включающего 9 таблиц и 19 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 198 литературных источников, в том числе 186 зарубежных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук.





МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В исследовании были использованы мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из периферической крови условно здоровых доноров, а также пациентов с ревматоидным артритом, атопическим дерматитом и бронхиальной астмой, находившихся на лечении в клинике иммунопатологии СО РАМН, г. Новосибирска в стадии обострения основного заболевания. Диагностика исследуемых заболеваний осуществлялась специалистами клиники в соответствии с общепринятыми критериями по каждой нозологической единице.

Получение МНК периферической крови. К периферической крови с 200 ЕД раствора гепарина добавляли 10% желатин и инкубировали 45 минут в термостате при 37 С. Полученную в результате лейковзвесь собирали, разбавляли забуферным физиологическим раствором (ЗФР) без натрия азида и центрифугировали в градиенте фиколл-верографин в течение 20 минут при 2,7 тыс. об/мин в центрифуге СМ-6М. Образовавшееся кольцо мононуклеарных клеток собирали и отмывали дважды ЗФР при 1,2 тыс об/мин в течение 5 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в ЗФР, подсчитывали количество клеток в камере Горяева и хранили в морозильной камере при -80С в FBS с 10% DMSO.

Протокол активации Т-лимфоцитов периферической крови. МНК, полученные из периферической крови, ресуспендировали в полной среде RPMI 1640 с добавлением 2 мг тиенама, 125 мкл гентамицина и 30 мг L-глютамина на 100 ml среды) и помещали в лунки 24-луночного планшета из расчета 1,5-2 млн клеток на 1 мл полной среды с 10% FBS и митогеном для Т-лимфоцитов (PHA-P в конечной концентрации 10 мкг/мл). Тщательно пипетировали, планшет помещали в СО2-инкубатор с температурой 37С на 72 часа. За 7,5 ч до конца культивирования добавляли раствор бромистого этидия (в конечной концентрации 10 мкг/мл), за 6 ч до окончания - раствор колхицина (в конечной концентрации 0,1 мкг/мл). По окончании культивирования суспензию клеток переносили в пробирки, центрифугировали, сливали культуральную среду.

Гипотонизация и фиксация ядер. Осажденные клетки ресуспендировали, к оставшемуся осадку аккуратно добавляли 1-2 мл гипотонического раствора KCl, осторожно взбалтывая пробирку. Затем доводили гипотоническим раствором до общего объема 9 мл. Суспензию тщательно перемешивали и помещали на 8-10 мин на водяную баню с температурой 37 С. По истечении времени гипотонии проводили предфиксацию: в суспензию добавляли несколько капель свежеприготовленного фиксирующего раствора (18 капель на 9 мл суспензии), аккуратно перемешивали и выдерживали 10-15 мин в холодильнике при +4С. Затем центрифугировали, сливали надосадочную жидкость, клеточный осадок ресуспендировали и аккуратно заливали небольшим количеством (1-2 мл) свежеприготовленного охлажденного до – 20С фиксатора, осторожно взбалтывая пробирку, и оставляли в холодильнике при – 20 С на 30 мин. По истечении времени центрифугировали, добавляли свежий фиксатор в нужном объеме (400-500 мкл), переносили в пробирки эппендорф и хранили в морозильной камере при – 20 С до использования.

Приготовление препаратов (Q-FISH - Quantitative fluorescent in situ hybridization). Приготовление препаратов проводили по стандартным протоколам [Poon S., 2001, Рубцов Н.Б., 2006]. Качество готовых препаратов контролировали под фазово-контрастным микроскопом. На влажное предметное стекло наносили 15 мкл суспензии хромосом и высушивали на водяной бане при +50С. После раскапывания препарат прогревали 1 ч в термостате при 65 С.. Перед проведением гибридизации проводили регидратацию препаратов путем погружения в 150 мл PBS буфера на 15 мин при комнатной температуре. Затем фиксировали слайды в 4% растворе параформальдегида в течение 2 мин с последующей трехкратной отмывкой в PBS буфере по 5 мин каждая. Препараты метафазных хромосом обрабатывали пепсином в растворе 0,01 N HCl, pH= 2.0 в течение 10 мин при 37 С. Отмывали дважды в PBS буфере по 2 мин. Повторяли фиксацию в 4% растворе параформальдегида с последующими отмывками. Затем препараты проводили через серию растворов этилового спирта возрастающей концентрации (70%, 90%, 96%) и высушивали при комнатной температуре. На сухую поверхность препарата наносили 2 капли по 10 мкл гибридизационного раствора под покровное стекло. Затем проводили денатурацию ДНК в термостате при 80С в течение 10 мин. Далее переносили препараты во влажную камеру и гибридизировали 2 часа при комнатной температуре в темноте. После гибридизации препараты отмывали 2 раза по 15 мин в отмывочном растворе №1 и 3 раза по 5 мин в отмывочном растворе №2 на шейкере. Затем препараты дегидротировали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации (70%, 90%, 96%) и высушивали. Препараты окрашивали DAPI (0,1 мкг/мл) под покровное стекло в течение 20 мин в темноте, затем осторожно снимали покровное стекло, наносили раствор Antifade Pro Long Gold, покрывали новым покровным стеклом и скрепляли клеем.

Получение и обработка изображения. Препараты анализировали на микроскопе “Axioplan 2 Imaging E-mot” (ZEISS), оснащенного лампами флуоресцентного и видимого света, с комплектом интерференционных фильтров фирмы CHROMA, для проведения 24-х цветной FISH. Ввод цифровой информации с помощью ССD-камеры CV M300; JAI Corporation, Japan, матрица 752 на 582 пиксела. PС (P-IV, 1,7 GH, 128 MB, 40 GB). Пакеты программного обеспечения ISIS4 фирмы MetaSystems GmbH, для работы с флуоресценцией.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.