WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Особенности экспрессии изоформ мрнк лейкемия-ингибирующего фактора и фактора стволовых клеток в фетальных тканях и мононуклеарных клетках человека на разных стадиях онтогенеза

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

САДОВСКАЯ ВЕРА АНАТОЛЬЕВНА

Особенности экспрессии изоформ мРНК лейкемия-ингибирующего фактора и фактора стволовых клеток в фетальных тканях и мононуклеарных клетках человека на разных стадиях онтогенеза

14.03.09 «Клиническая иммунология, аллергология»

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Новосибирск 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Сенников Сергей Витальевич

Официальные оппоненты:

Суховей Юрий Геннадьевич, доктор медицинских наук, профессор, Тюменский филиал Федерального Государственного Бюджетного Учреждения "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, директор

Шурлыгина Анна Вениаминовна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт физиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории хронофизиологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Томск)

Защита состоится «__»_________2013 г. В ___ часов на заседании диссертационного совета Д001.001.01 в ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН

Автореферат разослан «___»_________________2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Кандидат медицинских наук Белогородцев Сергей Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время широко изучается значение альтернативного сплайсинга в иммунопоэзе в норме и при патологии. Определяется роль изоформ мРНК цитокинов в развитии не только иммунной системы, но и функционировании других систем организма. Например, показано значение и возможности коррекции патологии репродукции с помощью таких цитокинов, как LIF, IL-11 [Dimitriadis, 2007]. Многие аутоиммунные процессы связаны с изменением альтернативного сплайсинга вовлеченных в патогенез белков [Evsyukova, 2010]. Несомненно, является важным изучение особенностей альтернативного сплайсинга цитокинов, участвующих в развитии иммунной системы и органогенеза на ранних этапах развития, чтобы расширить представления о значении, распространении альтернативного сплайсинга в этих процессах, найти возможности поиска ранних маркеров нарушений развития. В настоящее время разрабатываются подходы специфической терапии, направленной на коррекцию процессинга мРНК при различных заболеваниях с использованием олигонуклеотидов, РНК-интерференции и других молекулярно-генетических методов, для чего тоже необходимо знание особенностей экспрессии изоформ мРНК.

Одними из основных факторов, участвующих в регуляции раннего иммунопоэза, являются лейкемия-ингибирующий фактор (LIF) и фактор стволовых клеток (SCF). Оба эти фактора играют важнейшую роль в пролиферации и созревании иммунокомпетентных клеток в печени, тимусе, костном мозге, а так же в процессах органогенеза. Эти цитокины являются основными медиаторами поддержания плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток [Kristensen, 2005; Hirai, 2011].

В различных исследованиях была показана роль LIF в поддержании плюрипотентности и пролиферации эмбриональных стволовых клеток, в пролиферации тимоцитов, в регуляции количества миелоидных предшественников в костном мозге, активации гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, при воспалении, стрессе и травме, в поддержании функций моторных нейронов, регуляции функций остеобластов [Escary, 1993; Patterson, 1994, Hirai, 2011; Sims, 2012]. При изучении процессов регуляции дифференцировки CD4+ клеток в разные классы Т-хелперов было показано, что LIF стимулирует образование регуляторных Т-клеток и подавляет индуцированную IL-6 продукцию IL-17 в Тх17, что является основой применения его рекомбинантных форм в терапии аутоиммунных заболеваний [Gao, 2009; Metcalfe, 2011]. Показано, что в тимусе уровень мРНК LIF, других цитокинов семейства IL-6 и SCF повышается с возрастом и коррелирует со снижением количества TREC в клетках тимуса. Предположительно, LIF и SCF участвуют в регуляции процессов инволюции тимуса [Sempowski, 2000]. В дополнении к этому LIF играет важную роль в образовании децидуальной ткани в эндометрии и имплантации, используется при лечении бесплодия [Dimitriadis, 2007]. Однако неясным остается, какова роль отдельных изоформ мРНК LIF в описанных процессах. При изучении экспрессии LIF у млекопитающих в различных тканях in vitro и in vivo было показано, что в результате транскрипции гена lif могут получаться три продукта. Эти транскрипты содержат альтернативные первые экзоны, соединенные с идентичными вторым и третьим экзонами [Rathjen, 1990]. Основные исследования экспрессии изоформ мРНК LIF проводились на мышах и клеточных линиях. Анализ транскриптов hLIF в культурах клеток человека выявил значительную вариабельность в профилях экспрессии. Исследований экспрессии сплайс-вариантов мРНК LIF у человека в период внутриутробного развития ранее не проводилось. Есть данные лишь об экспрессии LIF в фетальных яичниках человека [Abir, 2004]. Данные об экспрессии изоформ LIF могли бы прояснить характер альтернативного сплайсинга LIF человека в период раннего иммунопоэза прежде всего в таких органах, как тимус, селезенка и печень. Это необходимо для дальнейшего изучения регуляции альтернативного сплайсинга этого цитокина, изучения изменений спектра изоформ при различных патологических состояниях и изучения функциональных особенностей изоформ.



Другим важным фактором роста является фактор стволовых клеток (stem cell factor, SCF). Анализ экспрессии гена scf в развивающихся эмбрионах показал, что этот цитокин играет важную и разнообразную роль в онтогенезе иммунной системы и кроветворения. SCF так же экспрессируется в компартментах развития стволовых кроветворных клеток и участвует в регуляции развития, пролиферации и миграции клеток иммунопоэза, меланоцитов и половых клеток [Sette, 2000; Toksoz, 1992]. Экспрессия SCF наблюдается в стромальных и добавочных клетках из микроокружения гематопоэтических клеток, включая клетки эндотелия, моноциты, фибробласты. Вместе с LIF SCF является необходимым фактором для раннего развития Т-лимфоцитов [Liu, 2012]. Особую роль играет SCF в В-лимфопоэзе. Он участвует в регуляции ранних этапов развития В-клеток. Известна способность SCF усиливать пролиферацию незрелых дендритных клеток in vitro. В присутствии SCF и IL-2 из CD34+ клеток образуются НК-клетки [Anderson, 1990; Broudy, 1997; Takatsu, 1997; Ashman, 1999]. Белок SCF человека синтезируется в двух формах – мембранно-ассоциированной и растворимой. Эти изоформы образуются из двух сплайсированных мРНК, в одной из которых отсутствует шестой экзон. В большинстве исследований особенности экспрессии изоформ мРНК SCF человека изучались на клеточных линиях и в тканях во взрослом периоде в норме и при различных патологиях [Smith, 2001; Reber, 2006; Krasaqakis, 2011; Menq, 2012]. Было показано, что изоформы обладают разной биологической активностью [Miyazawa, 1995; Mauduit, 1999; Hutt, 2006]. Остаются неясными особенности синтеза разных изоформ мРНК SCF и их значение на этапе внутриутробного развития человека, когда наблюдается высокая активность экспрессии этого фактора при процессах органогенеза, раннего иммунопоэза.

Представляется актуальным изучить особенности экспрессии сплайс-изоформ этих двух ростовых факторов в тканях человека, участвующих в формировании гемо- и иммунопоэза во внутриутробном периоде, и определить изменения в спектре экспрессии изоформ в мононуклеарных клетках крови в течение онтогенеза.

Цель исследования. Изучить экспрессию сплайс-вариантов мРНК лейкемия-ингибирующего фактора и фактора стволовых клеток в фетальных тканях человека и в мононуклеарных клетках периферической крови на разных этапах онтогенетического развития.

Задачи исследования:

1. Определить наличие сплайс-вариантов мРНК лейкемия-ингибирующего фактора в образцах фетальных тканей человека.

2. Выявить наличие и спектр экспрессии сплайс-вариантов мРНК лейкемия-ингибирующего фактора в мононуклеарных клетках периферической крови человека в пренатальный, неонатальный и постнатальный этапы развития.

3. Исследовать экспрессию сплайс-вариантов мРНК фактора стволовых клеток в различных фетальных тканях человека.

4. Изучить изменения экспрессии сплайс-вариантов мРНК фактора стволовых клеток в мононуклеарных клетках периферической крови человека на разных этапах онтогенетического развития: пренатальном, неонатальном и во взрослом периоде.

Научная новизна. Впервые изучен тканеспецифический характер экспрессии изоформ мРНК LIF в различных фетальных тканях человека. В тканях, участвующих в формировании гемо- и иммунопоэза (печень, селезенка и тимус), выявлены достоверные различия в экспрессии изоформ. Так, в печени, являющейся центральным органом гемопоэза во внутриутробном периоде, обнаружена высокая частота встречаемости экспрессии обоих сплайс-вариантов мРНК LIF, в селезенке экспрессия изоформ встречалась со средней частотой и определялась только мембранная изоформа мРНК LIF-M, в тимусе частота встречаемости экспрессии LIF была низкой и определялась только растворимая форма мРНК LIF-D.

В работе впервые охарактеризован спектр экспрессии изоформ мРНК LIF в мононуклеарных клетках крови человека в разные периоды онтогенетического развития. Показано достоверное снижение частоты встречаемости экспрессии изоформ мРНК LIF в мононуклеарных клетках крови новорожденных по сравнению с клетками плодов 22-х недель гестации. У взрослых доноров экспрессии не выявлено.

Впервые показан спектр экспрессии изоформ мРНК SCF в различных типах тканей на этапе внутриутробного развития человека. Это дополняет имеющиеся данные об экспрессии изоформ мРНК SCF в тканях во взрослом периоде развития. Впервые продемонстрирована стадиеспецифичность для экспрессии изоформ мРНК SCF в мононуклеарных клетках периферической крови человека на разных этапах развития. Частота встречаемости экспрессии изоформ мРНК SCF в этих клетках снижается от пренатального периода к неонатальному и исчезает во взрослом периоде развития.





Теоретическая и практическая значимость работы. В работе продемонстрировано, что экспрессия генов цитокинов LIF и SCF в фетальных тканях человека происходит с участием альтернативного сплайсинга. При этом наблюдается тканеспецифический характер экспрессии. Полученные результаты изучения экспрессии генов цитокинов позволяют расширить представления о полиморфизме цитокиновой сети. Показанные в работе факты экспрессии генов LIF и SCF человека в виде нескольких изоформ предоставляют новые данные об особенностях альтернативного сплайсинга этих цитокинов в период внутриутробного развития и в течение онтогенеза человека. Данные о тканеспецифическом и стадиеспецифическом характере экспрессии этих ростовых факторов у человека позволяют дифференцировать подходы к применению их рекомбинантных форм в терапии, учитывая характер альтернативного сплайсинга мРНК.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспрессия генов цитокинов lif и scf в фетальных тканях и мононуклеарных клетках периферической крови человека происходит с участием альтернативного сплайсинга.

2. Экспрессия изоформ мРНК цитокинов LIF и SCF человека имеет тканеспецифический и стадиеспецифический характер в онтогенезе.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007 г.); 2) Всероссийской научной конференции "Объединенный Иммунологический Форум" (Санкт-Петербург, 2008 г.). Апробация диссертации состоялась 26 октября 2012 г. на семинаре ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 137 страницах машинописного текста, включающего 2 рисунка и 10 таблиц. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 175 литературных источников, в том числе 168 зарубежных. Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фетальные ткани и кровь плодов человека. В работе исследовали фетальные ткани (печени (n=7), селезенки (n=5), тимуса (n=6), яичников (n=5), семенников (n=4), почки (n=5), мозга (n=7), надпочечников (n=3) и зачатков зубов (n=3)) и кровь плодов (n=12) от относительно здоровых женщин (средний возраст 26 ± 3 лет), у которых беременность была прервана по социальным показаниям (средний срок гестации составил 20-22 недели). Прерывание беременности индуцировали путем интраамниального введения 25мг энзапроста. Отсутствие внутриутробной инфекции (герпес, гепатиты В и С, цитомегаловирус, и т.д.) у плода было подтверждено результатами бактериологического и гистологического исследования абортивного материала и последа. Образцы предоставлены из банка биоматериалов лаборатории клеточных биотехнологий (зав. лабораторией д.м.н. Селедцова Г.В.). Образцы тканей замораживались и хранились в жидком азоте. Кровь плодов собиралась в пробирки с 1 мл 0,5М ЭДТА.

Пуповинная кровь новорожденных. В исследование были включены женщины, у которых беременность завершилась срочными, самопроизвольными родами. Пуповинную кровь здоровых, доношенных новорожденных (n=13) в объеме 5-7 мл получали после пересечения пуповины, когда плацента еще находилась в полости матки (in uteri). Для этого дренировали пупочную вену, и кровь самотеком поступала в стерильную пробирку с 700 мкл 0,5 М ЭДТА.

Все исследования с фетальными тканями и плодовой/пуповинной кровью были одобрены Локальным этическим комитетом и проводились при наличии информированного согласия пациентов (номер протокола №72 от 26.09.2012г.).

Мононуклеарные клетки периферической крови человека. Источником мононуклеарных клеток (МНК) послужила венозная кровь доноров, пуповинная кровь новорожденных и кровь из сердца плодов на 20-22 неделях развития. МНК выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (=1,082 г/л; фиколл (Pharmacia Fine Chemicl, Sweden), урографин (Шеринг АО, Германия)). Для этого 5 мл крови наслаивали на 3 мл раствора фиколл-урографина и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин [30]. МНК, собранные из интерфазы, отмывали средой RPMI-1640 (ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск) 3 раза путем ресуспендирования и последующего центрифугирования при 1000 оборотов/мин в течение 10 минут.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.