WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

Аллельный полиморфизм и альтернативный сплайсинг в формировании полиморфности цитокиновой сети

-- [ Страница 2 ] --

Образцы ДНК. Образцы ДНК 300 женщин больных РМЖ были предоставлены НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН г.Томск, 300 образцов ДНК женщин популяционного контроля (жительницы Западно-Сибирского региона) предоставлены НИИ терапии СО РАМН, в рамках выполнения интеграционного проекта СО РАМН.

Все исследования были одобрены локальным этическим комитетом НИИКИ СО РАМН и проводились при наличии информированного согласия пациентов, соответствующие исследования и сбор образцов также был одобрен локальными этическими комитетами организаций, предоставивших образцы ДНК.

МНК выделяли стандартным методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урогравина. Культивировали в среде RPMI - 1640 содержащей: 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Perbio), 2 мM/л L-глютамина, 100 мг/л ампицилина и 50 мг/л гентамицина. Концентрация клеток в начале культивирования составляла 1x106/мл. Жизнеспособность клеток не изменялась в процессе культивирования и составляла не менее 98%, по окраске трипановым синим или эритрозином В. Растворы митогенов и цитокинов добавляли в культуральную среду однократно вначале культивирования в следующих концентрациях: КонА - 10 мкг/мл или ЛПС (серотип 055:В5) в дозе 10 мкг/мл, rhIL-2 – 10 нг/мл, rhIL-4 – 5 нг/мл, rhIL-IL-42 – 100 нг/мл, rhIFN – 3 нг/мл, rhIL-18 - 40 нг/мл, rhIL-10 15 нг/мл, ЕРО – 5U/мл.

Количественную оценку уровней цитокинов проводили на электрохемилюминометре ORIGEN Analyzer (IGEN Inc., USA), электрохемилюминесцентным методом как описано ранее [Крысов С.В., 2000]. А также методом ИФА согласно рекомендаций производителей наборов. Индекс стимуляции рассчитывался как простое отношение уровня в стимулированной культуре к уровню в культуре без стимуляции.

Выделение нуклеиновых кислот проводили классическими методами с использованием фенол хлороформенной экстракции [Маниатис Т., 1984, Chomczynski P., 1987].

Определение мРНК цитокинов проводили с использованием ОТ-ПЦР с детекцией продуктов в агарозных и полиакриламидных гелях.

Количественную оценку уровня мРНК проводили с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени. Детектируя сигнал интеркалирующего красителя SYBRGREEN.

Генотипирование полиморфизмов цитокинов проводили методами ПДРФ анализа и аллельспецифической ПЦР, с детекцией результатов в агарозных и полиакриламидных гелях.

Статистический анализ результатов Оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием online калькулятора [http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml]. Сравнения частот аллелей и генотипов между исследованными выборками проводили используя критерий 2 и точный критерий Фишера. Расчет отношения шансов и 95% доверительного интервала (OR, 95% СI) и относительных рисков проводили с использованием статистических калькуляторов OpenEpi [http://www.openepi.com] и GenExpert [http://gen-expert.ru/calculator_or.php]. Для сравнения распределения частот аллелей и генотипов с другими популяциями были использованы сведения по исследуемым полиморфизмам из баз данных NCBI по референтным популяциям (в ss66857510): для европеоидов -CEU-GENO-PANEL, афроамериканцев -AAM-GENO-PANEL и азиатскойрасы -CHBGENO-PANEL [ http://ncbi.nlm.nih.gov/SNP/] , а также данные «SNP500Cancer database» [http://variantgps.nci.nih.gov]. Связь генотипов с продукцией цитокинов оценивали применяя непараметрический анализ Краскела-Уоллиса или критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при достижении уровня значимости p0,05. Данные в иллюстрациях приведены как медиана и квартили (25 и 75 перцентиль), а также минимальное и максимальное значение (Min – Max). В пояснениях к иллюстрациям приведены значения критериев и достигнутого уровня статистической значимости, количество проанализированных образцов обозначено - n.

РЕЗУЛЬТАТЫ

  1. Результаты исследования продукции цитокинов у носителей разных аллельных вариантов генов в норме.

В результате исследований уровня продукции IL-1 не выявлено значимой ассоциации в культурах МНК (интактных и стимулированных ЛПС или КонА) с генотипами доноров в позициях -31T>C и +3954C>T гена IL1B. Однако при анализе индексов стимуляции продукции IL-1 установлена их статистически значимая связь с комбинацией генотипов исследованных полиморфных вариантов. В частности в таблице 1 приведены данные иллюстрирующие, что носители сочетания -31ТТ/+3954СТ демонстрируют сниженную стимуляцию митогеном КонА продукции IL-1 в сравнении с носителями сочетания -31ТС/+3954СТ.

Таблица 1 - Индексы стимуляции продукции IL-1 митогеном - КонА в кондиционных средах МНК ПК у носителей разных сочетаний генотипов гена IL1B.

Сочетание генотипов IL1В -31T>C/+3954C>T Медиана Квартиль 1 (25%) Квартиль 2 (75%)
ТT/СТ 1,18 0,69 3,40
TС/СТ 1,93 1,40 4,80


Примечание: приведенные данные имеют статистически значимые отличия (n= 67, p 0,05).

Анализ уровня продукции IL-2 в культурах МНК доноров с разными аллельными вариантами +114G>T гена IL2 не выявил значимых различий в уровнях спонтанной и КонА стимулированной продукции IL-2 в кондиционных средах, полученных через 24 и 48 часов культивирования МНК.

Выявлена статистически значимая связь продукции TNF- с полиморфными вариантами промоторного региона гена в точках -238G>A и -857C>T. Так носители генотипа -238GG характеризовались сниженной спонтанной продукцией TNF- в культурах МНК в сравнении с гетерозиготами -238GА (Н=3,8; Z= -1,92; p=0,05), в тоже время при стимуляции клеток КонА вызывала у них более выраженное усиление продукции этого цитокина (Н=3,95; Z= -1,99; p=0,046), данные приведены в таблице 2.

Аналогично, носители генотипа -857СС характеризовались меньшей продукцией TNF- в культурах МНК при обработке клеток КонА (Z= -1,98; p=0,047); в сравнении с носителями альтернативных генотипов (таблица 3). Индексы стимуляции продукции TNF- митогеном КонА также были незначительно повышены в группе носителей аллеля Т, в сравнении с гомозиготами СС, однако критического уровня значимости эти различия не достигали.

Tаблица 2 - Продукция TNF- в культурах мононуклеарных клеток условно здоровых доноров – носителей разных генотипов в позиции -238G>A промотора гена TNF (n= 148).

Медиана Квартиль 1 (25%) Квартиль 2 (75%) Генотип
Спонтанная (пг/мл) 93,6 * 31,3 181,6 GG
222,4 81,0 365,2 GA
Стимулированная КонА (пг/мл) 261,8 144,0 489,0 GG
428,4 238,8 652,2 GA
Индекс КонА 3,0 * 1,9 5,5 GG
2,2 1,7 3,0 GA

Примечание: * -статистически значимые отличия от группы носителей оппозитного генотипа ( р 0,05).

Tаблица 3 - Продукция TNF- в культурах мононуклеарных клеток условно здоровых доноров – носителей разных генотипов в позиции -857С>Т промотора гена TNF (n= 148).

Медиана Квартиль 1 (25%) Квартиль 2 (75%) Генотип
Спонтанная (пг/мл) 91,4 26,5 186,8 CC
131,4 56,4 213,1 CT+TT
Стимулированная КонА (пг/мл) 213,2 * 133,1 475,8 CC
307,2 195,4 551,7 CT+TT
Индекс КонА 2,9 1,8 4,7 CC
3,3 2,0 6,7 CT+TT


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.