WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 ||

Аллельный полиморфизм и альтернативный сплайсинг в формировании полиморфности цитокиновой сети

-- [ Страница 6 ] --

В фетальных тканях, имеющих непосредственное отношение к гемопоэзу и иммунопоэзу (тимус, печень, селезёнка) количественно охарактеризован уровень матричных РНК IL-4 и IL-42 методом ОТ-ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в «реальном времени». Результаты анализа представлены на рисунке 4. Показано, что экспрессия полноразмерного варианта IL-4 в тимусе в среднем на 1-2 порядка выше, чем в печени и селезёнке. Количественный анализ мРНК IL-42 показал, что в фетальной печени его в среднем в 2-5 раз больше чем в селезёнке и сопоставим с уровнем выявляемым в тимусе.

 Относительные количества мРНК IL-4 и IL-42 в фетальных тканях-5 Относительные количества мРНК IL-4 и IL-42 в фетальных тканях-6

Рисунок 4 - Относительные количества мРНК IL-4 и IL-42 в фетальных тканях человека. Данные приведены в относительных единицах как среднее +стандартное отклонение для четырех образцов тканей печени, селезенки и тимуса.

Было исследовано влияние некоторых цитокинов (IL-2, IL-4, IL-42, IL-10, IL-18, IFN и эритропоэтин) на спектр экспрессируемых мРНК интерлейкина-4 в культуре МНК периферической крови здоровых людей (рисунок 5А).

 Изменение спектра сплайс-вариантов мРНК цитокинов в МНК человека-7  Изменение спектра сплайс-вариантов мРНК цитокинов в МНК человека-8

Рисунок 5 – Изменение спектра сплайс-вариантов мРНК цитокинов в МНК человека под действием внешних факторов. А - Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР мРНК гена IL4 в МНК ПК человека, культивированных в присутствии рекомбинантных цитокинов: 1 – без цитокинов, 2 - rhIL-2, 3 - rhIL-4, 4 – rhIL-42, 5 - rhIL-10, 6 - rhIL-18, 7 - rhIFN и 8 – EPO, М-маркер молекулярного веса pBluscriptII/ MspI. Отмечены: полноразмерный вариант мРНК IL-4 (288 п.о.), IL-42 мРНК (240 п.о.), IL-4alt3 мРНК (215 п.о.). Б - Электрофореграмма в продуктов ОТ-ПЦР IL-6 на матрицах кДНК из нативных и культивированных МНК ПК. 1-4 - донор 1, 5-8 – донор 2. М - маркер молекулярного веса pGK3/HaeIII (видны полосы 734, 525, 503, 404). 1 и 5 - интактные МНК, 2 и 6 - МНК после культивации, 3 и 7 - МНК культивированные с добавлением КонА (10 мкг/мл), 4 и 8 - МНК культивированные с добавлением IL-18 (40 нг/мл).

В исследованных образцах выявлены мРНК IL-4 и мРНК IL-42, а в МНК некоторых доноров, культивированных в присутствии rhIL-18 был обнаружен дополнительный фрагмент меньшего размера (рисунок 5А) его нуклеотидная последовательность, соответствует мРНК с делецией фрагмента третьего экзона и обозначена как IL-4alt3. Также показано, что в процессе культивирования МНК происходит изменение спектра выявляемых сплайс-вариантов мРНК гена IL6 – описанная впервые изоформа мРНК IL-624 исчезает (рисунок 5Б).

В фетальных тканях определяются тот же спектр матричных РНК интерлейкинов -4 и -6, что и в МНК взрослых людей, однако в период эмбрионального развития имеет место неравнозначное распределение сплайс-вариантов в разных тканях человека, что может отражать процессы, лежащие в основе дифференцировки тканей, в том числе регулируемые IL-6 (таблица 8). Кроме того установлено что в МНК человека спектр образующихся сплайс-вариантов мРНК цитокинов зависит от микроокружения и внешних сигналов, в том числе цитокиновых. Это свидетельствует о значимости альтернативного сплайсинга как механизма регуляции функциональной активности цитокинов.

Экспрессия сплайс-вариантов мРНК генов SCF и LIF в фетальных тканях человека имеет неоднородный характер и встречается не во всех исследуемых тканях. В таблице 9 приведены значения частот встречаемости изоформ, показана избирательная экспрессия изоформ мРНК в зависимости от типа тканей на сроке 20-22 недель внутриутробного развития человека. LIF преимущественно экспрессируется в тканях печени, мозга, надпочечниках и тканях зачатков зубов. При этом типы преобладающей изоформы в тканях мозга, печени, тимуса и селезенки отличаются, что указывает на различные биологические функции изоформ LIF.

Таблица 9 - Частота встречаемости альтернативных транскриптов LIF в фетальных тканях плодов 20-22 недель гестации.

Изоформы hLIF-D растворимая hLIF-M матрикс-ассоциированная hLIF-T внутриклеточная SCF растворимый SCF мембраный
Фетальные ткани
Печень 7/7 (100%) 3/7 (42.86%) 0/7 5/7 (71,4%) 4/7 (57,1%)
Тимус 1/6 (16.67%)

0/6 (0%) 0/6 4/6 (66,7%) 2/6 (33,3%)
Селезенка 0/5 (0%) 2/5 (40%) 0/5 2/5 (40%) 2/5 (40%)
Яичники 1/5 (20%) 1/5 (20%) 0/5 2/5 (40%) 2/5 (40%)
Семенники 1/4 (25%) 1/4 (25%) 0/4 3/4 (75%) 3/4 (75%)
Почка 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 3/5 (60%) 2/5 (40%)
Надпочечники 3/3 (100%) 2/3 (66.67%) 0/3 3/3 (100%) 3/3 (100%)
Мозг 2/7 (28.57%) 5/7 (71.4%) 0/7 5/7 (71,4%) 5/7 (71,4%)
Зачатки зубов 2/3 (66.67%) 1/3 (33.33%) 0/3 1/3 (33,3%) 0/3
Щит. железа 0/1 (0%) 0/1 (0%) 0/1 0/1 0/1
Легкие 0/1 (0%) 0/1 (0%) 0/1 1/1 (100%) 0/1
Кожа 1/1 (100%) 1/1 (100%)
Примечание: числитель дроби – количество выявленных положительных образцов, знаменатель – общее количество образцов.

В большинстве изученных тканей, кроме тканей зачатков зубов, щитовидной железы и легкого была выявлена экспрессия обеих изоформ мРНК SCF, что свидетельствует о возможной гетерогенности клеток-продуцентов фактора стволовых клеток и разнонаправленном регуляторном действии этого цитокина в пренатальный период развития (таблица 9). Отмечается неоднородность экспрессии изоформ в пределах разных тканей одного организма и от образца к образцу одной ткани, что доказывает тканеспецифический характер регуляции альтернативного сплайсинга SCF.

Результаты анализа экспрессии сплайс-вариантов мРНК генов LIF и SCF в мононуклеарных клетках человека представлены в таблице 10. В МНК крови плодов на 20-22 неделях развития во всех образцах выявили изоформы мРНК LIF-D и LIF-M и лишь в одном из образцов – LIF-T. В МНК, выделенных из пуповинной крови, было показано, что экспрессия LIF носит разнородный характер и отличается у разных новорожденных. При этом только у трех из тринадцати новорожденных выявлены две формы мРНК (LIF-D и LIF-M) одновременно. В МНК периферической крови транскриптов LIF не было выявлено. Результаты анализа экспрессии мРНК SCF в МНК в целом повторяют ситуацию, выявленную для LIF. Снижение частоты выявления всех вариантов мРНК генов LIF и SCF в онтогенезе можно объяснить уменьшением интенсивности процессов пролиферации стволовых элементов иммунной системы, а так же снижением интенсивности гистогенеза и соответственно снижением количества мигрирующих клеток, экспрессирующих LIF и SCF.

Таблица 10 - Частота встречаемости альтернативных транскриптов LIF и SCF в МНК крови человека на разных этапах онтогенеза.

Изоформы МНК крови плодов 20-22 недель n=5 МНК пуповинной крови новорожденных n=13 МНК периферической крови взрослых n=15
hLIF-D растворимая 5/5 (100%) 4/13 (30,8%) 0/15
hLIF-M матрикс-ассоциированная 5/5 (100%) 5/13 (38,5%) 0/15
hLIF-T внутриклеточная 1/5 (20%) 0/13(0%) 0/15
SCF растворимый 5/5 (100%) 3/13 (23,1%) 0/15
SCF мембраносвязанный 5/5 (100%) 5/13 (38,5%) 0/15
Примечание: числитель дроби – количество выявленных положительных образцов, знаменатель – общее количество образцов.




Результаты исследования экспрессии генов IL4, IL6, LIF и SCF в фетальных тканях человека показывают, что экспрессия указанных генов происходит с участием альтернативного сплайсинга. В целом спектр сплайс-форм мРНК выявляемый в тканях, соответствует спектру сплайс-форм, описанному у взрослого человека. Для генов цитокинов характерна тканеспецифичность экспрессии сплайс-вариантов выявляемая как для разных тканей одного организма, так и для одной ткани разных организмов. Исследование сплайс-вариантов мРНК в мононуклеарных клетках периферической крови показало, что спектр, баланс и уровень мРНК сплайс-вариантов цитокинов может изменяться под действием внешних сигналов, например при стимуляции клеток митогенами или другими цитокинами. Исследование экспрессии сплайс-форм мРНК цитокинов в МНК на разных стадиях онтогенеза свидетельствует о значимом вкладе сплайс-вариантов цитокинов в регуляцию гистогенеза на ранних стадиях онтогенетического развития.

Обобщая результаты проведенных исследований можно говорить, что аллельный полиморфизм генов и альтернативный сплайсинг транскриптов цитокинов являются весьма важными факторами, которые формируют сруктурное и функциональное многообразие в системе цитокиновой регуляции. В частности, генетический полиморфизм оказывает преимущественное влияние на количественный (уровень цитокинов), а альтернативный сплайсинг преимущественно на качественный (спектр цитокинов) уровни формирования полиморфности в регуляторной цитокиновой сети.

ВЫВОДЫ

  1. Формирование полиморфности цитокиновой сети происходит с участием аллельных вариантов генов цитокинов, о чем свидетельствуют результаты исследования их ассоциации с уровнем продукции конечных белков и развитием заболеваний, а также с участием альтенативного сплайсинга, что подтверждается тканеспецифичностью экспрессии сплайс-форм мРНК ряда цитокинов и изменением их спектра в онтогенезе и под действием внешних факторов.
  2. Аллельный полиморфизм промотора гена TNF в позициях -238 и -857 является функционально значимым. У условно здоровых доноров носителей генотипа -857СС снижена КонА-стимулированная продукция TNF- в культурах МНК ПК, а у носителей генотипа -238GG снижена спонтанная продукция и повышен индекс стимуляции, по сравнению с носителями альтернативных аллельных вариантов.
  3. Показано, что среди условно здоровых доноров носители сочетания генотипов гена TNF -238GG/-308GG/-857CC/-1031NC, характеризуются статистически значимо наименьшей спонтанной и митоген-стимулированной продукцией TNF-, а носители сочетания -31ТТ/+3954СТ гена IL1B демонстрировали сниженную стимуляцию митогеном КонА продукции IL-1 в сравнении с носителями сочетания -31ТС/+3954СТ. Это указывает на участие аллельного полиморфизма генов в формировании индивидуальных особенностей уровня продукции цитокинов.
  4. Аллельные варианты цитокинов IL-1 и IL-18 имеют значимую ассоциацию с предрасположенностью к развитию рака молочной железы и особенности распределения частот генотипов в группах больных, различающихся по типу выявленного рака и характеру роста опухоли, что свидетельствует о прогностической значимости аллельных вариантов IL1В +3954, IL18 -137 и IL18 -607 при раке молочной железы в исследованной популяции жительниц Юго-Западной Сибири.
  5. Повышение частоты генотипа GG и аллеля G в позиции -238 и снижение частоты аллеля С в позиции -857 промотора гена TNF у больных ревматоидным артритом, по сравнению с группой популяционного контроля, указывает на ассоциированность этих аллельных вариантов промотора гена TNF с заболеванием.

  6. Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 ||
     


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.