WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях

-- [ Страница 2 ] --
  1. МСК различного тканевого происхождения имеют тканеспецифические различия по количеству клоногенных предшественников, пролиферативному и остеогенному потенциалу, а также продукции цитокинов, участвующих в поддержании кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов.
  2. Изменения свойств костномозговых МСК при гемобластозах, аутоиммунных заболеваниях и циррозе печени проявляются снижением количества клоногенных предшественников МСК, их пролиферативной и супрессорной активности, а также остеогенного потенциала в культуре in vitro.
  3. Основной фактор роста фибробластов повышает in vitro пролиферативную активность МСК больных с иммунопатологическими заболеваниями и у пациентов с аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени корригирует иммуносупрессорную активность и остеогенный потенциал МСК.
  4. Использование низких доз МСК (в диапазоне от 0,01 до 1,1 х106 клеток/кг) является безопасным и повышает эффективность трансплантации аутологичных ГСК у больных гемобластозами за счет сокращения сроков цитопении, более эффективной реконституции Т-клеток и снижения частоты тяжелых инфекционных осложнений (мукозитов, энтеропатий).

Апробация работы

Результаты доложены и обсуждены на Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik International» (Москва, 2004); на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет» (Новосибирск, 2005); на Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (С-Пб., 2005); на Всероссийских научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005; Красноярск, 2006; Омск, 2007; Томск, 2008; Красноярск, 2010); на Международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005); на 10-ом конгрессе ESPRAS (European Societies of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery) (Вена, 2005); на Международной конференции “Basic science for Biotechnology and Medicine” (Новосибирск, 2006); на Всероссийской и Международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2007); на 3-ей международной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2007); на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); на II Съезде терапевтов Республики Казахстан (Алматы, 2009); на Всероссийской научной школе-конференции (Москва, 2010); на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» (Санкт-Петербург, 2010); на 7-ой и 8-ой отчетных конференциях НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2008, 2011); на 2-ой и 3-ей конференциях Международной ассоциации по нейрореконструкции (Пекин, 2009 и 2010); на 36-ой и 37-ой Annual Meeting of European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) (Флоренция, 2008; Париж, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 53 печатных работы, в том числе 18 статей в рецензируемых журналах, защищен 1 патент, зарегистрирована 1 новая медицинская технология

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 182 страницах машинописного текста, включающего 28 таблиц и 24 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 248 литературных источников, в том числе 240 иностранных.

Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии ФГБУ НИИКИ СО РАМН (зав. лабораторией – член-корр. РАМН, д.м.н., проф. Черных Е.Р.) в рамках темы НИР 030 «Молекулярно-генетические механизмы регуляции стволовых клеток и клеток-предшественников в норме и при иммунопатологических состояниях. Разработка высокоэффективных биотехнологических методов трансплантации стволовых клеток (в том числе генно- и цитокин-модифицированных) в лечении основных заболеваний человека» и темы НИР 037 «Разработка новых клеточных технологий в лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека на основе изучения биологических свойств и молекулярно-генетических механизмов регуляции стволовых и иммунокомпетентных клеток».

Образцы тканей для получения МСК были любезно предоставлены д.м.н., проф. Добряковой О.Б. и к.м.н. Дробинской А.Н. Автор выражает искреннюю признательность коллективу Отделения гематологии и трансплантации костного мозга (зав. отделением – к.м.н. Крючкова И.В.), иммунологического отделения (зав. отделением – к.м.н. Старостина Н.М.) и всем сотрудникам лаборатории клеточной иммунотерапии НИИКИ СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа основана на результатах исследования мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из костного мозга доноров (n=30) и больных (n=200) с различными иммунопатологическими заболеваниями, жировой (n=41) и плацентарной ткани (n=31).

Характеристика больных, включенных в исследование. В исследование были включены 147 больных гемобластозами (84 мужчины и 63 женщины, в возрасте от 8 до 56 лет, медиана 33 года), находившиеся на лечении в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии ФГБУ НИИКИ СО РАМН. У 52 пациентов была диагностирована неходжкинская лимфома (НХЛ), у 46 – лимфома Ходжкина (ЛХ), у 28 – множественная миелома (ММ), у 21 больного - апластическая анемия (АА). В исследование также были включены 36 пациентов (26 мужчин и 21 женщина в возрасте от 15 до 64 лет) с циррозом печени (ЦП) различного класса тяжести по Child-Pugh (класс А, n=16; класс В, n=15; класс С, n=5). Кроме того, исследовали 17 пациентов (3 мужчин и 14 женщин в возрасте от 18 до 49 лет) с аутоиммунными заболеваниями, включая 10 - с системной красной волчанкой (СКВ), 2 – с ревматоидным артритом (РА), 3 – с аутоиммунным ЦП и 2 – с системной склеродермией (ССД).



Иммунологические исследования.

Получение и культивирование мононуклеарных и ядросодержащих клеток. Костный мозг получали путём трепанобиопсии из крыла подвздошной кости. МНК выделяли страндартно центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина. Ткань плаценты, полученную после физиологических родов (при наличии информированного согласия женщины), измельчали, отмывали в PBS и обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА/0,1% коллагеназы 1а типа (Sigma-Aldrich, США) в течение 40 минут. Жировую ткань получали в ходе операций эстетической хирургии, при наличии информированного согласия пациента. Липоаспираты отмывали в PBS 3-5 раз и обрабатывали 0,1% раствором коллагеназы 1а (Sigma-Aldrich, США) в течение 40 минут. Для получения популяции МСК костномозговые МНК и ядросодержащие клетки жировой/плацентарной ткани культивировали в среде -MEM («БиолоТ», С-Пб) c 20% FCS («БиолоТ», С-Пб) в CO2-инкубаторе. Через 24 ч неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток культивировали до покрытия клетками 80-90% площади флакона. Пассирование МСК осуществляли с использованием 0,25% раствора трипсина (Sigma-Aldrich, США) и 0,02% раствора ЭДТА (ICN, США) в течение 5-10 минут. Интенсивность деления МСК оценивали по времени достижения конфлюэнтного роста в первичных культурах (1-й пассаж) и по количеству генерированных «дочерних» клеток в пересчете на 1 КОЕ-Ф.

Исходное количество клоногенных прекурсоров МСК в исследуемых тканях определяли по числу фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф). Для этого 1х106 МНК костного мозга или ядросодержащих клеток жировой ткани/плаценты культивировали в чашках Петри (Nunclon, Дания) в среде МЕМ с 20% FCS в течение 14 суток. По окончании культивирования клетки окрашивали по Романовскому-Гимза, затем подсчитывали число колоний, содержащих не менее 50 фибробластоподобных клеток.

Морфометрию МСК проводили в мазках, окрашенных азур-эозином, с использованием компьютеризированной видеосистемы со встроенным интерфейсом (MicroMed Images 1.0) с последующей оценкой характера распределения клеток по величине их диаметра в интервале <10 — >60 мкм с шагом 10 мкм.

Оценку экспрессии поверхностных маркеров проводили методом проточной цитофлюориметрии на лазерном клеточном анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием FITC- или PE-меченных моноклональных анти-CD3, -CD14, -CD16, -CD20, - CD34, -CD73, -CD90, -CD105, -HLA-DR антител. Для определения относительного содержания CD4+CD45RO+-, CD4+CD45RA+-, CD8+CD45RO+- и CD8+CD45RA+ Т-лимфоцитов, а также CD4+CD25high и CD4+FOXP3+ регуляторных Т-клеток использовали FITC-меченные анти-CD4, -CD8 и -CD25 («Сорбент», Россия) и РЕ-меченные анти-CD45RO, -СD45RA и FOXP3 моноклональные антитела (Becton Dickinson, США).

Оценка остеогенной и адипогенной дифференцировки МСК. МСК, полученные при первом пассаже, культивировали в индукционной среде, содержащей -глицерофосфат, дексаметазон и фосфат аскорбиновой кислоты (остеогенная дифференцировка), либо дексаметазон, 3-изобутил-1-метилксантин и индометацин (адипогенная). В контрольных культурах клетки культивировали в стандартной среде. Через 18 суток оценивали эффективность дифференцировки МСК с помощью окраски по von Kossa в первом случае и Oil Red O (Sigma-Aldrich, США) во втором. Маркером остеогенной дифференцировки являлась продукция кальций-содержащего матрикса, окрашиваемого нитратом серебра в черный цвет, адипогенной – появление в цитоплазме клеток липидных вакуолей, окрашиваемых в красный цвет.

Полуколичественный метод оценки остеогенного потенциала МСК. Сравнительный анализ выраженности/интенсивности остеогенной дифференцировки МСК проводили в соответствии с разработанным нами ранее полуколичественным методом (Патент РФ № 2370771), основанном на измерении оптической плотности культур МСК в заданном диапазоне 2-х кратно возрастающих клеточных концентраций после их культивирования в остеогенной индукционной среде в течение 18 сут и окрашивания депозитов кальция по von Kossa. Интенсивность цветовой реакции оценивали на фотометре Multiskan Ascent (Thermo Electron Corp., Финляндия) при длине волны 492 нм. Интенсивность дифференцировки выражали в виде Индекса Остеогенной Дифференцировки, ИОД (отношение оптической плотности в опытных образцах к таковой в контрольных).

Исследование функциональной активности МСК. Определение концентраций цитокинов (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-, MCP-1 (MCAF), MIP-1, TNF-) в супернатантах конфлюэнтных и стандартизованных (50х103 МСК/лунку; 48 ч; в отсутствие/присутствии липополисахарида E.coli в дозе 10 мкг/мл; Sigma-Aldrich, США) культур МСК проводили на 2-хлучевом лазерном автоматизированном анализаторе BioPlex Protein Assay System (BioRad, США) с использованием коммерческих тест-систем Human Cytokine 17-Plex Panel. Методом ИФА оценивали содержание эритропоэтина (Pro-Con EPO-HS, Протеиновый контур, Россия), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1, Diagnostic System Laboratories, США), основного фактора роста фибробластов (Human FGF basic, Biosource, Бельгия), эпидермального ростового фактора (Pro-Con EGF, Протеиновый контур, Россия), фактора роста эндотелия сосудов (Human VEGF Immunoassay Kit, Invitrogen, США) и HLA-G (sHLA-G ELISA, Exbio, Чехия)..





Влияние МСК на пролиферативный ответ активированных Т-клеток оценивали в анти-CD3-стимулированных культурах и двунаправленной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ). Различные количества МСК (для получения соотношений 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:100) культивировали в течение 24 ч в питательной среде в плоскодонных 96-луночных планшетах. К созданному монослою добавляли МНК здоровых доноров. В случае двунаправленной СКЛ в лунки вносили по 0,1х106 МНК от двух доноров и культивировали в течение 5 сут в среде RPMI-1640 с 10% FCS. Митоген-индуцированный пролиферативный ответ оценивали в 3-суточных культурах МНК доноров (0,1х106/лунку), активированных анти-CD3 моноклональными антителами ICO-90 (анти-CD3, 1 мкг/мл, «Медбиоспектр», Москва). Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина. Контролем служил уровень пролиферативного ответа МНК в отсутствие МСК. В отдельной серии экспериментов МСК предварительно обрабатывали (45 мин, 370С) индометацином (100 мкг/мл) или ингибитором ИДО – 1-метилтриптофаном (1-МТ; 500 мМ).

Для оценки влияния МСК на экспрессию активационных молекул на Т-лимфоцитах МНК доноров, стимулированные моноклональными анти-CD3-антителами (1 мкг/мл), культивировали в отсутствие/присутствии МСК (в соотношении МНК:МСК=10:1) в RPMI-1640 с 10% FCS. Через 72 ч собирали неприкрепленные к пластику клетки, и методом проточной цитометрии оценивали относительное количество CD25+ и HLA-DR+ клеток в лимфоцитарном гейте.

Влияние МСК на колониеобразующую активность костномозговых гемопоэтических предшественников оценивали по количеству эритроидных, гранулоцитарно-макрофагальных и смешанных колоний, полученных в результате 14-дневного культивирования МНК костного мозга в отсутствие/присутствии МСК (1:1 и 1:10) в полужидкой метилцеллюлозной среде МethoCult (Stem Cell Technologies, Канада).

Ретроспективный анализ ко-трансплантации МСК и ГСК у больных злокачественными лимфомами. В исследование были включены 126 больных (72 мужчины и 54 женщины; от 8 до 56 лет), которым проводилась аутологичная трансплантация ГСК в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии НИИ Клинической иммунологии СО РАМН. У 52 пациентов была диагностирована неходжкинская лимфома (НХЛ), у 46 – лимфома Ходжкина (ЛХ), у 28 больных – множественная миелома (ММ). Всем пациентам проводилась стандартная мобилизация, сепарация и трансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после высокодозной химиотерапии, у 65 больных трансплантация ГСК была дополнена введением аутологичных МСК.

МСК генерировали из прилипающей фракции аспирата костного мозга в течение 17-20 дней согласно описанной ранее технологии [наша технология] с последующим криоконсервированием в растворе альбумина («Микроген», Россия), содержащем 10% DMSO (Sigma-Aldrich). Клетки размораживали непосредственно перед введением при 37°C, с использованием водяной бани, отмывали и вводили в 20 мл физиологического раствора внутривенно после трансплантации ГСК. Количество трансплантированных МСК варьировало от 0,01 до 1,1 х106 клеток/кг веса больного (медиана 0,17 х106 клеток/кг).

У всех пациентов оценивали абсолютное количество лимфоцитов до мобилизации, в продукте сепарации, после ТГСК (на момент выхода из лейкопении) и при выписке. Раннее восстановление лимфоцитов (РВЛ) считалось наступившим, если выход из цитопении (лейкоциты 1x109/L) наступал не позднее 15 дня после ТГСК, а количество лимфоцитов в периферической крови при этом составляло 500 и более клеток /мкл.

Относительное содержание CD4+CD45RO+-, CD4+CD45RA+-, CD8+CD45RO+- и CD8+CD45RA+ Т-лимфоцитов, а также CD4+CD25high и CD4+FOXP3+ регуляторных Т-клеток оценивали до ТГСК (перед началом кондиционирования) и после ТГСК на момент выписки из стационара (в среднем на 23-й день).

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики с использованием программ «STATISTICA 8.0» и «GraphPad 5.0».

Результаты и обсуждение

Характеристика МСК различного тканевого происхождения

Сравнительная характеристика МСК, генерированных из костного мозга, жировой и плацентарной ткани, показала, что исследуемые клетки отличались адгезивностью, образовывали кластеры вытянутых веретенообразных клеток (рис. 1А) и были способны к экспансии in vitro (рис. 1Б).

 Фибробластоподобные адгезивные клетки (на примере полученных-0  Фибробластоподобные адгезивные клетки (на примере полученных из-1  Фибробластоподобные адгезивные клетки (на примере полученных из-2
Рис. 1. Фибробластоподобные адгезивные клетки (на примере полученных из костного мозга): А – 5 дней культивирования (нативный препарат, увеличение x250); Б – 13 дней культивирования (нативный препарат, увеличение х250).


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.