WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |

Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях

-- [ Страница 3 ] --

Анализ исходного количества прекурсоров МСК показал (табл. 1), что в костном мозге количество КОЕ-Ф составляло в среднем 37 колоний на 106 МНК. Содержание КОЕ-Ф в плацентарной ткани было сопоставимым, а в жировой ткани – в 1,5 раза выше (табл. 1). Тем не менее, клетки всех тканей были способны к интенсивному делению. При этом в культурах плацентарных клеток, совершавших более 12 удвоений клеточной популяции, наблюдался наибольший выход МСК, т.е. количество получаемых при пассировании клеток.

Сравнительная морфометрическая оценка МСК различного тканевого происхождения показала (рис. 2), что в первичных культурах КМ- и Ж-МСК относительно мелкие клетки (менее 20 мкм) составляли примерно 30% от общей популяции. В то же время в культурах П-МСК количество мелких клеток было в 1,5 раза выше, составляя в среднем 49%.

Фенотипический анализ МСК показал (рис. 3), что подавляющее большинство генерируемых клеток вне зависимости от тканевой принадлежности экспрессировали специфичные для МСК «стромальные» маркеры (CD73, CD90 и CD105).

Таблица 1
Содержание клоногенных прекурсоров и пролиферативная активность МСК, выделенных из костного мозга, жировой и плацентарной ткани
Показатель МСК, полученные при первичном культивировании
Костный мозг (n=14) Жировая ткань (n=9) Плацента (n=14)
Кол-во клоногенных прекурсоров МСК (КОЕ-Ф) 37 ± 5 (34) 53 ± 7 *# (57) 32 ± 6 (33)
Время до субслияния (сутки) 15,6 ± 0,9 (16) 12,5 ± 2,8 (10) 13,5±0,9 (12) *
Выход МСК на 1 КОЕ-Ф 4996 ± 1498 (2414) 3004 ± 231 (2125) 8250 ± 2190 *# (4591)
Количество удвоений клеточной популяции 11,6 ± 0,4 (11) 11,7 ± 0,8 (11) 12,3 ± 0,5 (12)
Примечание: данные представлены в виде М ± S.E. (Median) * - p<0,05, достоверность различий по сравнению с костным мозгом; # - p<0,05, достоверность различий по сравнению с жировой тканью (критерий U - Вилкоксона-Манна-Уитни)

Оценка дифференцировочного потенциала продемонстрировала, что МСК всех трех тканей в равной степени были способны к билинейной (остео/адипогенной) дифференцировке (рис. 4).

 Распределение МСК (пассаж 1) по размерам диаметра клеток. -3  Распределение МСК (пассаж 1) по размерам диаметра клеток. -4
Рис. 2. Распределение МСК (пассаж 1) по размерам диаметра клеток. Рис. 3. Фенотипическая характеристика МСК (пассаж 1).

Однако анализ остеогенного потенциала МСК с помощью разработанного нами ранее полуколичественного метода показал, что КМ-МСК отличаются наиболее выраженным остеогенным потенциалом. Действительно, в культурах КМ-МСК с минимальной клеточной концентрацией (625 клеток/лунку) значения индекса остеогенной дифференцировки (ИОД) были значительно выше по сравнению с П-МСК и Ж-МСК (1,63 vs 1,17 и 1,09 расч.ед., соответственно). При этом Ж-МСК эффективно дифференцировались в остеогенном направлении только при высоких клеточных концентрациях (5000-10000 клеток/лунку).

 Остеогенная (А) и адипогенная (Б) дифференцировка МСК.-5  Остеогенная (А) и адипогенная (Б) дифференцировка МСК. Окраска-6  Остеогенная (А) и адипогенная (Б) дифференцировка МСК. Окраска-7  Остеогенная (А) и адипогенная (Б) дифференцировка МСК. Окраска-8
Рис. 4. Остеогенная (А) и адипогенная (Б) дифференцировка МСК. Окраска матрикса по Ван Коса и липидных вакуолей Oil Red O.


Следующий этап работы был посвящен определению цитокинового профиля МСК. С этой целью культуры МСК были стандартизованы по количеству клеток-продуцентов (50х103 МСК/лунку) и длительности культивирования (в течение 48 ч). Из данных рисунка 5 видно, что МСК различного тканевого происхождения спонтанно продуцируют IFN-, IL-6, хемокины – IL-8 и МСР-1, а также FGF-basic, G-CSF, VEGF и IGF-1.

 Спонтанная продукция цитокинов (пг/мл) в культурах МСК. КМ-МСК-9
Рис. 5. Спонтанная продукция цитокинов (пг/мл) в культурах МСК. КМ-МСК (n=3); П-МСК (n=3); Ж-МСК (n=4). * - pU<0,05 vs КМ-МСК; # - pU <0,05 vs П-МСК.

При этом КМ- и П-МСК в целом были схожи между собой по уровню и профилю секретируемых Th1/про- и Th2/противовоспалительных цитокинов, за исключением IL-13, который не продуцировался КМ-МСК, но определялся в супернатантах П-МСК. В то же время П-МСК отличались достоверно сниженной интенсивностью секреции VEGF, IGF-1 и MIP-1 и повышенным уровнем продукции IL-8. Ж-МСК, в отличие от костномозговых и плацентарных клеток, более активно секретировали IFN-, IL-2, IL-1, TNF-, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF и все хемокины. Таким образом, по характеру и уровню базальной продукции цитокинов МСК, выделенные из жировой ткани, в большей степени характеризуются более выраженным провоспалительным, иммунорегуляторным и гемопоэзстимулирующим потенциалом.

Сравнение уровня ЛПС-стимулироанной продукции цитокинов показало (рис. 6), что КМ- и П-МСК отличались высокой ЛПС-реактивностью, поскольку в митоген-стимулированных культурах активно продуцировали (ИВЛПС3,0) Th1/провоспалительные и Th2 цитокины (IL-4, IL-6), все хемокины, а также ростовые факторы гемоиммунопоэза (G-CSF и GM-CSF). Выявленные ранее различия КМ- и П-МСК по уровню спонтанной продукции медиаторов проявлялись и в ЛПС-стимулированных культурах. Так, в ответ на ЛПС интенсивность секреции VEGF, IGF-1 и MIP-1 была ниже, а секреция IL-8 и IL-13 – достоверно выше в культурах П-МСК, чем в культурах костномозговых клеток.

Рис. 6. Индексы влияния ЛПС на продукцию цитокинов КМ-, П- и Ж-МСК. Цветовая кодировка и обозначение статистически достоверных различий соответствуют рис. 5.

МСК жировой ткани, обладая исходно повышенной секреторной активностью, характеризовались более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции, что проявлялось меньшими значениями ИВЛПС для IFN-, IL-1, TNF-, IL-17, IL-4, IL-6, GM-CSF, IL-8, MCP-1 и MIP-1. Таким образом, цитокиновый профиль МСК указывает на значительную роль МСК в регуляции репаративных процессов не только в физиологических условиях, но и при различных повреждающих воздействиях (при активации МСК через TLR).

Исследование гемопоэзстимулирующей активности МСК показало, что МСК, выделенные из различных тканей, стимулируют образование эритроидных, гранулоцитарно-макрофагальных и колоний смешанного типа в культурах МНК костного мозга (рис. 7). При соотношении МСК:МНК=1:1 количество КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в целом по группе возрастало примерно в 3-4 раза. Но даже в присутствии более низких концентраций МСК (1:10) колониеобразование сохранялось на достаточно высоком уровне, достоверно превышающем контрольные значения. При этом гемопоэзстимулирующая активность МСК была характерна для всех типов МСК, которые по степени выраженности данной биологической активности достоверно не различались между собой.

Сравнительный анализ иммуносупрессорных свойств МСК показал, что наиболее выраженной супрессией в анти-CD3-стимулированных культурах отличались КМ-МСК, которые в соотношении 1:1 - 1:4 подавляли пролиферацию Т-клеток в среднем на 65 и 52%, соответственно (рис. 8). Анти-пролиферативная активность П-МСК и Ж-МСК в соотношении 1:1 была сопоставимой (55 и 74% супрессии). При уменьшении числа МСК в культуре отмечалось отчетливое дозозависимое ослабление иммуносупрессорного потенциала этих клеток.

 Влияние МСК различных тканей на колониеобразующую активность-10 Влияние МСК различных тканей на колониеобразующую активность-11 Влияние МСК различных тканей на колониеобразующую активность-12
Рис. 7. Влияние МСК различных тканей на колониеобразующую активность гемопоэтических предшественников. МНК костного мозга доноров культивировали в течение 14 суток в отсутствие (контроль) или в присутствии МСК (МСК:МНК= 1:1 и 1:10) в полужидкой метилцеллюлозной среде, с последующим подсчетом количества эритроидных, гранулоцитарно-макрофагальных и смешанных колоний (на 105 МНК). * - pU < 0,05, достоверность различий по сравнению с контролем (U – критерий Викоксона-Манна-Уитни).




В случае активации Т-клеток аллоантигенами (рис. 8) наиболее «супрессивными» оказались П-МСК, подавляющие в соотношении 1:1 пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на 80-90% (по сравнению с 70-75%).

 Супрессорный эффект КМ-, П- и Ж-МСК на пролиферацию анти-CD3--13  Супрессорный эффект КМ-, П- и Ж-МСК на пролиферацию анти-CD3- (А)-14
Рис. 8. Супрессорный эффект КМ-, П- и Ж-МСК на пролиферацию анти-CD3- (А) и аллоантиген- (Б) активированных Т-лимфоцитов. Показаны уровни супрессии под влиянием МСК (%; M ± S.E.), выделенных из костного мозга (n=5), жировой (n=8) и плацентарной ткани (n=16). * и # – pU<0,05 - достоверность различий по сравнению с аналогичными культурами КМ- МСК и П-МСК (U - критерий Вилкоксона-Мана-Уитни).

супрессии для Ж- и КМ-МСК). Супрессорный потенциал КМ-МСК в СКЛ также был значительным и сохранялся неизменным при уменьшении количества МСК.

Таким образом, можно заключить, что МСК различного тканевого происхождения, в целом отвечая Минимальным критериям, имеют определенные тканеспецифические особенности. Так, жировая ткань отличается максимальным количеством клоногенных прекурсоров МСК; МСК плацентарной ткани характеризуются наибольшей пролиферативной активностью; КМ-МСК проявляют наиболее выраженный остеогенный потенциал. При этом все типы МСК эффективно стимулируют дифференцировку кроветворных клеток-предшественников, но различаются по уровню иммуносупрессорной активности в отношении Т-клеток, активированных митогеном или аллоантигенами.

Характеристика МСК костного мозга при иммунопатологических заболеваниях

Следующий этап исследования был посвящен характеристике свойств КМ-МСК у больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями. При большинстве исследуемых патологий количество клоногенных прекурсоров МСК (КОЕ-Ф) в костном мозге больных было в той или иной степени снижено (рис. 9). Наиболее выраженное и статистически значимое снижение количества КОЕ-Ф регистрировалось у больных лимфомами и АИЗ.

Рис. 9. Количество клоногенных предшественников МСК (КОЕ-Ф) у доноров и больных. Данные представлены в виде индивидуальных значений (медиана ± интерквартильный диапазон). pU<0,05 – достоверность различий выборок по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |
 


Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.