WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 |

Рецепция половых стероидных гормонов как критерий прогноза и повышения эффективности экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов

-- [ Страница 2 ] --

23 (5)

Факторы бесплодия, % (кол-во пац.)

- мужской

21 (6)

23 (5)

- трубно-перитонеальный

64 (18)

64 (14)

- эндометриоз

25 (7)

14 (3)

- неясного генеза

14 (4)

9 (2)

- поздний репродуктивный возраст (от 37 до 39 лет)

18 (5)

27 (6)

- сочетание нескольких факторов

21 (6)

9 (2)

Количество попыток ЭКО в анамнезе

1,1±1,5

0,7±1

Таким образом, как видно по представленной выше таблице, обе группы достоверно не отличались по изученным параметрам.

В нашей работе, помимо общепринятых методов обследования перед проведением ЭКО и ПЭ согласно 67 приказу Минздрава РФ, проводились дополнительные анализы: определение уровня рецепторов эстрадиола и прогестерона в цитозоле эндометрия и в клетках МНФК. Определение рецепторов прогестерона и эстрадиола в цитозольной фракции проводили по методу Л. С. Бассалык [19870. Связывание стероидных гормонов в цитозоле выражали в фемтомолях гормона, связанного одним мг цитозольного белка. Выделение мононуклеарной фракции крови по методу Boyum A. [1983].

Цитозольную фракцию получали из биопсийного материала эндометрия дифференциальным ультрацентрифугированием, в которой определяли уровень РЭ и РП.

В крови определяли уровень эстадиола и прогестерона твердофазным хемилюминесцентным иммуноанализом, а также выделяли МНФК.

Выделенную фракцию МНФК периферической крови оценивали с помощью проточной цитофлуорометрии. В МНФК определяли уровень рецепторов радио-лигандным методом с использованием 3Н-эстрадиола и 3Н-прогестерона по методу Л. С. Бассалык [1987]. Для отделения несвязанной метки использовали стеклянные фильтры GF/B. Все исследования проведены в триплетах. Белок в цитозольной фракции определяли методом Lowry O.H. [1951]. РП и РЭ в эндометрии определяли радио-лигандным методом с использованием 3H-эстрадиола-17бета и 3H-прогестерона («Amersham» GB).

На 20-22 день менструального цикла, перед взятием пациентки в цикл ЭКО, проводилась пайпель-биопсия эндометрия (у 31 пациентки, т.е. у 62%, у остальных данная процедура оказалась технически невозможной). Часть материала сразу же замораживалась для последующего определения РЭ и РП, а часть – фиксировалась в формалине для последующего гистологического исследования. В этот же день производился забор венозной крови из кубитальной вены с последующим определением уровня эстрадиола, прогестерона и уровня рецепторов на клетках МНФ (контрольная точка), повторного клинического анализа крови. Дополнительно забор крови для определения уровня рецепторов на клетках МНФ осуществлялся также в день забора яйцеклеток (2-я точка определения и в день трансфера эмбрионов в полость матки (3-я точка определения).

Лечение проводилось по стандартному длинному протоколу ЭКО. Предварительную десенситизацию гипофиза проводилась агонистом гонадотропин-релизинг-гормона (аГнРГ) трипторелином – Диферелином фирмы “Beaufour Ipsen International”, Франция (Диферелин 0,1мг ежедневно подкожно или Диферелин 3,75мг однократно). После контроля УЗИ в начале менструального цикла, через 10-14 дней десенситизации аГнРГ начиналась cтимуляция суперовуляции препаратами гонадотропинов, рекомбинантными (фоллитропином альфа – ГоналФ фирмы “Merck Serono”, Швейцария, а также фоллитропином бета – Пурегон фирмы “Organon”, Нидерланды) или мочевыми (менотропинами – Менопур фирмы “Ferring”, Германия) в индивидуально подобранных дозах от 100 до 300 МЕ на фоне продолжающегося ежедневного подкожного введения Диферелина 0,1мг в половинной дозе, т.е. по 0,05мг. За 36-38 часов “овуляторная” доза хорионического гонадотропина 10.000 МЕ (Прегнил фирмы “Organon”, Нидерланды). Поддержка лютеиновой фазы всем пациенткам назначалась одинаковая: микронизированный прогестерон (Утрожестан фирмы “Besins”) 600 мг/сут в 3 приема интравагинально до результата на ХГЧ, в случае наступления беременности – еще, как минимум, 2 недели.

Трансвагинальная пункция и аспирация преовуляторных ооцитов проводилась через 35-36 часов после инъекции ХГЧ. Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся через 48-120 часов после начала культивирования in vitro. Одной пациентке переносилось до 3-х эмбрионов под контролем УЗИ абдоминальным датчиком аппарата фирмы “Bruel & Kier” (Дания). Эмбрионы на стадиях 2-10 бластомеров или на стадии бластоцисты набирались в специальный стерильный одноразовый катетер (мягкий катетер фирмы “Wallace”, Великобритания или “Labotech”, Германия). При невозможности пройти цервикальный канал мягким катетером использовались наборы Set TDT фирмы “C.C.D. International”, Франция.





Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0. для каждой из непрерывных величин приведены -среднее (М) и стандартное отклонение (CD) или медиана и верхняя и нижняя квартили в зависимости от типа распределения исследуемой величины. Гипотеза о нормальном распределении изучаемого показателя проверялись с использованием критерия Шапиро-Вилкса. При сравнении групп пациентов по основным показателям, полученным при включении в исследование, в зависимости от характера распределений использовались U- критерий Манна-Уитни. Для статистического изучения связи между различными параметрами применялся непараметрический метод - коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования гормонального статуса на 2 - 4-й дни менструального цикла до включения пациенток в протокол лечения показали, что уровни гонадотропинов, ТТГ, половых стероидов и их соотношение, у всех пациенток находились в пределах нормативных значений. Результаты проведенного исследования показали, что уровни исследованных гормонов и их соотношение у пациенток обеих групп до начала процедуры ЭКО достоверно не отличались (p>0,05).

Стимуляция суперовуляции вызывала значительное увеличение концентрации и эстрадиола и прогестерона по сравнению с нормой (при овуляции в интактном половом цикле) в 5-7 раз. Избыток женских половых стероидов явился следствием роста большого количества фолликулов.

В момент трансфера эмбриона в полость матки концентрация эстрадиола была выше нормативных значений практически в 46 раз и составляла 4585,6±103,8 pmol/l и в 10 раз выше, чем в контрольной точке, до начала стимуляции. Концентрация прогестерона составляла 428,1±19,3 nmol/l, что в 10 раз превышает значения в контрольной точке, и в 9 раз - нормативные значения.

Таким образом, при исследовании гормонального статуса нами было выявлено следующее:

  1. Базальный уровень эстрадиола, ФСГ, ЛГ и их соотношение, уровень тестостерона, пролактина и ТТГ у пациенток репродуктивного возраста с регулярным менструальным циклом с трубно-перитонеальным, мужским и сочетанными факторами бесплодия, а также с эндометриозом и бесплодием неясного генеза достоверно не отличались у пациенток с удачным и неудачным исходами лечения в стандартном длинном протоколе ЭКО и ПЭ;
  2. Не выявлено достоверной разницы в уровне эстрадиола и прогестерона по группам в динамике в цикле ЭКО и ПЭ.

Морфологическое исследование биоптатов эндометрия перед проведением цикла ЭКО показало, что соответствие морфологической картины эндометрия хронологической фазе цикла было выявлено у 50,0% больных I группы (с успешной попыткой ЭКО) и у 30,8% во II группе с неэффективной попыткой ЭКО. Функциональное несоответствие эндометрия (а точнее, его отставание) фазе менструального цикла: у 44,5% пациенток в группе с успешной попыткой ЭКО и ПЭ и у 61,6% пациенток с неудачной попыткой ЭКО и ПЭ. Ни в одной группе не было выявлено ни одного случая опереженного созревания эндометрия.

Таким образом, наши данные иллюстрируют ненадежность критериев Noyes’ для оценки полноценности эндометрия, что также подтверждается другими исследователями. Так, по данным Coutifaris et al. 2004, у 49% фертильных и 43% бесплодных женщин по данным пайпель-биопсии эндометрий оказывается “не в фазе”. Если к этому прибавить сведения о том, что несовпадение оценок морфологии эндометрия среди гистологов встречается в 20-40% случаев [Duggan et al. 2001; Gibson et al. 1991; Scott et al. 1993; Smith et al. 1995], то целесообразность проведения данного вмешательства для оценки функционального состояния эндометрия и вовсе ставится под сомнение.

Нами также не было выявлено влияния самой процедуры взятия пайпель-биопсии эндометрия на последующий результат лечения, что идет вразрез с имеющимися в настоящее время литературными данными (Barash A et al. 2003; Raziel A et al. 2007; Zhou L et al. 2008). Возможно, отсутствие доказательства влияния данной процедуры на результат связано с малым объемом выборки (пайпель-биопсию удалось произвести лишь у 31 женщины) и однократностью вмешательства (так, например, Barash A и соавторы в 2003 проводили ее четырежды [34]).

Разделение пациенток на группы по признаку успешной имплантации не привело к выявлению достоверной разницы в рецепции женских половых стероидов в цитозоле эндометрия в зависимости от эффекта терапии.

У пациенток с успешной имплантацией уровень цитозольных рецепторов эстрадиола был максимальным и равнялся 30,57±14,28 фемтомоль/мг белка цитозоля. У женщин с отсутствием имплантации величина этого показателя была ниже и равнялась 9,325±9,325 фемтомоль/мг белка. Средняя концентрация рецепторов прогестерона у пациенток с успешной имплантацией составляла 152,9±65,69 фемтомоль/мг белка, тогда как при ее отсутствии - 164,3±107,4 фемтомоль/мг белка.

Индивидуальный анализ полученных данных показал, что у пациенток с успешной имплантацией частота встречаемости нулевых значений уровня стероидных рецепторов в цитозоле эндометрия достоверно ниже по сравнению со второй группой: для РП - 37% против 57% (р0,05), для РЭ - 12% против 42% (р0,01). Не удивительно, что это правило распространяется и на отрицательные по обоим рецепторам образцы эндометрия: 12% в первой группе (успех имплантации) против - 29% во второй (р0,01).

Таким образом, окончательный анализ результатов нашего исследования не подтвердил гипотезу о достаточной информативности рецепции стероидов в эндометрии для прогноза успеха ЭКО. При этом, биопсия эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является причиной отказа пациенток от нее. Также не всем пациенткам удаётся произвести данную процедуру в связи со спазмом внутреннего зева, стенозом или особенностями направления хода цервикального канала. Так, в нашем исследовании у 19 (38%) из 50 пациенток биопсию эндометрия взять не удалось. Более того, массированная инфильтрация эндометрия иммунокомпетентными клетками в период имплантационного окна [Dekel N., 2010] позволяет переместить акценты нашего внимания на рецепцию женских половых стероидов именно в этих клетках.

Учитывая, что основным объектом нашего исследования являлась мононуклеарная фракция периферической крови, нами был проведен индивидуальный анализ данной фракции на содержание В- и Т-лимфоцитов и моноцитов с помощью проточного цитофлюориметра сортера FACSAria (Becton Dickenson Co). Полученные данные не отличаются от нормативных показателей мононуклеарной фракции периферической крови, все показатели периферического анализа крови пациенток сравнимы и достоверно не отличаются.

Значение клеток мононуклеарной фракции периферической крови (МНФК) в функционировании маточно-плацентарной единицы подробно изучено [Dekel N., 2010]. В частности, им отводится роль сдерживания системной иммунной реакции матери на аллогенный трансплантат (эмбрион) за счет продукции ингибирующих факторов. С другой стороны, мононуклеарные клетки крови находятся под гормональным контролем, т.к. в достаточном количестве экспрессируют рецепторы половых стероидов. Следовательно, нарушение рецепции половых стероидов на уровне МНФК может быть одной из причин бесплодия. Приведенные аргументы явились основанием для поиска критерия прогноза эффективности длинного протокола ЭКО и сравнения уровня рецепторов половых стероидов в МНФ периферической крови в группах больных с наступившей имплантацией и без таковой.

Кроме того, сравнительный анализ позволил выявить достоверную положительную корреляцию между рецепцией прогестерона в МНФК и цитозоле эндометрия, для РП коэффициент корреляции Spearman r = 0,71 (P=0,0032, alpha=0.05). В то же время не обнаружено корреляции в рецепции эстрадиола, что может быть следствием недостаточности объема выборки для данного параметра.

Приведенные нами данные свидетельствуют о том, что введение пациенткам препаратов для суперовуляции вызывает изменение плотности рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках периферической крови. Так, в день пункции фолликулов величина этого параметра и РЭ увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной точкой и составила для РП в среднем 36,48 ± 7,42 фемтомоль/млн.клеток с индивидуальными колебаниями от 4,3 до 63,4 фемтомоль/млн.клеток, а для РЭ - 7,28 ± 1,8 фемтомоль/млн.клеток с индивидуальными колебаниями от 1,4 до 20,6 фемтомоль/млн.клеток А в момент трансфера для РП равнялась 32,37 ± 9,2 фетомоль/млн.клеток с изменениями от 1,1 до 78,9 фемтомоль/млн.клеток, а для РЭ – увеличилась практически в 2 раза и равнялась 9,64 ± 3,65 фемтомоль/млн.клеток с изменениями от 1,0 до 26,4 фмоль/млн.клеток..

Анализ полученных данных показал, что средняя концентрация РП/РЭ в контрольной точке равнялась 10,96 ± 3,45, в день пункции яичников величина этого параметра составила в среднем 7,06 ± 1,26, в момент трансфера – 14,21 ± 7,8.

Таким образом, введение пациенткам препаратов для стимуляции суперовуляции (гонадотропинов на фоне агонистов гонадолиберинов) вызывает у них увеличение соотношения РП/РЭ в момент переноса эмбриона и снижение – в момент пункции и увеличение уровня РП и РЭ в МНФК периферической крови, что не удивительно, так как первую (начало протокола) и вторую (забор яйцеклеток) точки разделяет введение высоких доз гонадотропинов, что как видно из приведенных данных, отражается не только на рецепторном профиле тканей репродуктивного тракта женщины, но и влияет на плотность рецепторов иммунокомпетентных клеток и тем самым увеличивая чувствительность мононуклеаров к прогестерону и эстрадиолу, что необходимо для инициации, координации и поддержки процесса имплантации. Обращает на себя внимание резкое снижение РП/РЭ в МНФК при отсутствии успеха.

Среднее значение уровня РП в МНФК у пациенток I группы (с наступившей в результате лечения беременностью) в середине лютеиновой фазы предшествующего ЭКО цикла составило 4,78 фемтомоль/млн клеток. У пациенток II группы (в случае неудачной попытки ЭКО) данный параметр был в 1,8 раза ниже и составил 2,8 фемтомоль/млн. клеток, что оказалось статистически значимо ниже, чем в I группе (р=0,043).

Еще более информативные данные получены при анализе концентрации рецепторов прогестерона в МНФК пациенток включенных в программу ВРТ в зависимости от успеха имплантации с поправкой на внеэндометриальные причины отсутствия имплантации, в частности такого фактора, как «эмбрионы сомнительного качества». Уровень рецепторов прогестерона в группе пациенток с наступившей беременностью был достоверно выше по сравнению с уменьшенной на 7 пациенток II группой (р=0,0024).



Pages:     | 1 || 3 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.