WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 8 |

Лекарственный патоморфоз эндокринной части поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете

-- [ Страница 2 ] --

Эксперименты выполнены на 610 половозрелых нелинейных белых крысах самцах массой от 280,0 до 300,0 г (табл. 1). Животные содержались в стандартных условиях вивария кафедры фармакологии ВолгГМУ на диете для лабораторных животных согласно ГОСТ Р50258 92. Проведение экспериментальной части исследования одобрено решением регионального независимого этического комитета (протокол №1-06; №43-2006; №70-2008; №89-2009) и выполнены согласно методическим руководствам и нормативным документам: правила лабораторной практики (GLP) при проведении доклинических исследований в РФ; Федеральный закон "О лекарственных средствах" N86-ФЗ от 22.06.1998 (Собрание законодательства РФ от 29.06.1998 г., N26, ст. 3006; от 13.01.2003 г. N2 ст. 167; от 10.01.2000 г., N2, ст. 126; от 07.01.2002 г. (Часть I), N1, ст. 2) и положение о Министерстве здравоохранения РФ, утвержденное постановлением Правительства РФ от 29.04.2002 N 284 (Собрание законодательства РФ, 06.05.2002 г., N18, ст. 1771), а также в соответствии с ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96. На момент проведения экспериментов животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было. Все манипуляции с животными проводили с соблюдением международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных (1997).

Таблица 1

Распределение животных по экспериментальным группам

Группы Время наблюдения, сутки Количество животных
Интактный контроль 3, 7, 14, 21, 28 50
Аллоксан-индуцированный СД 3, 7, 14, 28 50
Аллоксан-индуцированный СД+инкретиномиметики 3, 7, 14, 28 50
Стрептозотоцин-индуцированный СД 7, 21 30
Стрептозотоцин-индуцированный СД +инкретиномиметики 7, 21 30
Иммунозависимый СД 3, 7, 14, 21 50
Иммунозависимый СД+инкретиномиметики 3, 7, 14, 21 50
Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД 3, 7, 21, 28 50
Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+бигуаниды 3, 7, 21, 28 50
Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+препараты сульфонилмочевины 2-го поколения 3, 7, 21, 28 50
Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+ингибиторы дипептидилпептидазы IV типа 3, 7, 21, 28 50
Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+антиоксиданты 3, 7, 21, 28 50
Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД+секретогены 3, 7, 21, 28 50
ВСЕГО 610

При проведении эксперимента у лабораторных животных контролировали массу тела, объём потребляемой жидкости, проводили глюкозотолерантный тест, а так же определяли уровень кетоновых тел в моче по стандартным методикам. В эксперимент производился отбор животных с уровнем сахара крови не ниже 15 ммоль/л., то есть крысы с индуцированным сахарным диабетом [Akbarzadeh A. et al., 2007]. Содержание гликозилированного гемоглобина (HbA1c) определяли методом катион-обменной хроматографии низкого давления со стандартными наборами («Фосфосорб», Россия). Концентрацию инсулина и С-пептида определяли в плазме крови брюшной аорты крыс на автоматическом иммуноферментном анализаторе «SUNRISE» фирмы TECAN (Австрия) с использованием наборов DRG Insulin Elisa Kit и DRG C-peptide Elisa Kit.

Экспериментальные формы сахарного диабета1:

Аллоксан-индуцированный СД вызывали внутрибрюшинным введением аллоксана в дозе 120 мг/кг [Srinivasan K., Ramarao P., 2007] с последующим введением экстракта Гимнемы лесной (перорально 280 мг/кг водного раствора, 2 р/сут.). Забор тканей для патогистологического исследования осуществляли на 3, 7, 14 и 28 сутки. Стрептозотоцин-индуцированный СД моделировали однократной в/в инъекцией стрептозотоцина (45 мг/кг) [Баранов А.Г., 1985]. На фоне развития диабета осуществляли введение экстракта Гимнемы лесной (перорально 280 мг/кг, 2 р/сут.). Забор тканей для патогистологического исследования осуществляли на 7 и 21 сутки. Иммунозависимый СД осуществляли инъекцией 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда п/к с последующими ежедневными в/в введением стрептозотоцина 20 мг/кг в течение 5 суток [Ziegler B. et al., 1990]. На фоне развития иммунозависимого СД осуществляли введение экстракта Гимнемы лесной (per os 280 мг/кг, 2 р/сут.). Забор тканей для патогистологического исследования осуществляли на 3, 7, 14 и 21 сутки. Стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный СД вызывали инъекцией стрептозотоцина (интраперитониально – 65 мг/кг) с предварительным (за 15 минут) введением никотинамида (интраперитониально – 230 мг/кг на 0,9% р-ре хлорида натрия) [Islam S. et al. 2007]. На фоне развития экспериментального диабета осуществляли введение: Метформин («Харман Файнокем», Индия) (интрагастрально, с 7 сут. после моделирования СД, в течение 28 сут. 1 р/сут. по 100 мг/кг); Глибенкламид («Hyderabad-500082», Индия) (интрагастрально, с 7 суток после моделирования СД, в течение 28 суток 1 р/сут. по 5 мг/кг); Диабенол («ООО След», Россия) (интрагастрально, с 7 сут. после моделирования СД, в течение 28 сут. 1 р/сут. по 25 мг/кг); Ванадий содержащий комплекс (интрагастрально, 100 мг/кг ежедневно в течение 14 сут., с 3 сут. после введения стрептозотоцина); Гликлазид (интрагастрально, 7,5 мг/кг, ежедневно в течение 14 суток, с 3 суток после введения стрептозотоцина); -липоевая кислота (18 мг/кг). Забор тканей для гистологического исследования осуществляли на 3, 7, 21 и 28 сутки (табл. 2).





Таблица 2

Антидиабетические лекарственные средства (ЛС) и лекарственные вещества (ЛВ), используемые для лечения экспериментального сахарного диабета

№ п/п Группы антидиабетических ЛС и ЛВ ЛС, ЛВ
1. Лекарственные средства, повышающие секрецию инсулина (секретогены) Производные сульфонилмочевины (ПСМ) 1. Глибенкламид 2. Гликлазид
3. Диабенол
2. Лекарственные средства, преимущественно повышающие чувствительность периферических тканей к инсулину (сенситайзеры действия инсулина) Бигуаниды Метформин
3. Лекарственные вещества, преимущественно повышающие чувствительность периферических тканей к инсулину (сенситайзеры действия инсулина) Соли ванадия Ванадий содержащий комплекс
4. Антиоксиданты Липоевая кислота -липоевая кислота
5. Инкретиномиметики Гимнемовые кислоты экстракт Гимнемы лесной

Морфологические методы исследования:

Для патогистологического исследования поджелудочную железу разделяли на три фрагмента: кишечную, желудочную и селезеночную, затем фрагменты фиксировали в 10% р-ре нейтрального забуференного формалина. Парафиновые срезы монтировали на предметные стёкла, обработанные адгезивным покрытием. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятым методикам [Коржевский Д.Э., 2005]. Иммуногистохимическое исследование выполнено в лаборатории морфологии и иммуногистохимии ГБУ ВМНЦ. Для типирования А- и В-клеток островков использовали первичные антитела к инсулину и глюкагону, для изучения апоптоза и пролиферативной активности - первичные антитела к про- и антиапоптогенным белкам (табл. 3).

Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии с протоколами фирм производителей с использованием систем детекции ABC, «UltraVision, «EnVision» и хромогеном – диаминобензидином (ДАБ), используя протокол высокотемпературной демаскировки антигенов [Kumar G.L. et al., 2009]. Характер иммуногистохимической реакции оценивали с помощью визуально-аналоговой шкалы по Allred D.C. et al. (1998) или определяли удельное количество позитивно окрашенных клеток стандартизированными методами морфометрии в иммуногистохимии с помощью системы анализа изображений [Dabbs D.J., 2010].

Таблица 3

Первичные антитела, используемые при проведении ИГХ

№ п/п Антитела Клон Производитель
1. Инсулин Поликлональные DakoCytomation, Дания
клон Ab-6 (INS04 + INS05) LabVision, Великобритания
2. Глюкагон Поликлональные Novocastra, Великобритания
3. Каспаза-3 JHM62 Novocastra, Великобритания
Rb-1197-P0 NeoMarkers, США
4. TRAIL(апоптоз индуцирующий лиганд фактора некроза опухоли) 27B12 Novocastra, Великобритания
5. MDM2 1B10 Novocastra, Великобритания
6. Bcl-2 sc-7382 Santa Cruz Biotechnology, США
7. p53 (Pab 240) MS-104-P0 NeoMarkers, США
8. Bax Поликлональные BD Biosciences Pharmingen, США
9. PCNA Поликлональные Dako Cytomation, Дания
(PC10) MS-106-P0 NeoMarkers, США
10. Ki-67 (ядерный антиген пролиферирующих клеток) MIB-1 Dako Cytomation, Дания
MM1 Novocastra, Великобритания
11. NOS-3 (эндотелиальная NO-синтаза) RN5 Novocastra, Великобритания
12. NF-kB (ядерный фактор kB) Поликлональные DiagnosticBioSystems, США


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 8 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.