WWW.ДЕНЬСИЛЫ.РФ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Медицина

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Патоморфологические особенности головного мозга при моделировании алиментарного дефицита магния (экспериментальное исследование)

-- [ Страница 2 ] --

Образцы головного мозга животных фиксировали в 10%-ом растворе формалина, приготовленном на 0,2M фосфатном буфере, и смеси Карнуа с дальнейшей гистологической проводкой и изготовлением парафиновых срезов

___________________________________________________________________________

*) Выражаем благодарность заведующему кафедрой фармакологии ВолгГМУ, академику РАМН, ЗДН РФ, д.м.н., профессору А.А. Спасову, к.м.н., ассистенту М.В. Харитоновой, к.м.н. А.А. Желтовой за помощь в проведении исследования

толщиной 5 мкм, которые окрашивали по стандартным методикам гематоксилином и эозином, тионином по Нисслю [Меркулов Г.А., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996].

Для иммуногистохимического исследования*) с целью определения экспрессии различных антигенов (белков семейства transient receptor potential melastatin – TRPM6, TRPM7; каспазы 3; кислого глиального фибриллярного белка (GFAP); эндотелиальной (e-NOS) и индуцибельной (i-NOS) нитрооксидсинтазы) использовали поли- и моноклональные антитела к соответствующим белкам. После депарафинизации проводили высокотемпературную демаскировку антигенов с помощью кипячения в 10% растворе высокощелочного (pH=9,0) фосфатного буфера. Последующие этапы окраски препаратов производились по алгоритмам и с использованием официнальных реактивов визуализирующей системы «UltraVision» (USA). В качестве хромогена использовали 1% раствор 3,3-диаминобензидина, затем препараты докрашивали гематоксилином и заключали в монтирующую среду. Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе «Micros» (Austria) цифровой фотокамерой «Olympus» (Japan). Для оценки результатов иммуногистохимической реакции использовали полуколичественную визуально-аналоговую шкалу, предложенную Allred D.C. [Allred D.C. et al., 1998]. С помощью этой шкалы оценивали удельное количество иммунопозитивных нейронов в баллах от 0 до 5 (0 – отсутствие иммунопозитивных клеток; 1 – удельное количество иммунопозитивных клеток 1-20%; 2 – удельное количество иммунопозитивных клеток 20-40%; 3 – удельное количество иммунопозитивных клеток 40-60%; 4 – удельное количество иммунопозитивных клеток 60-80%; 5 – удельное количество иммунопозитивных клеток 80-100%), а также интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3 (0 – иммунонегативная реакция; 1 – слабо выраженное окрашивание; 2 – умеренно выраженное окрашивание; 3 – максимально выраженное окрашивание). Производили суммирование баллов удельного количества иммунопозитивных клеток и интенсивности окрашивания и, таким образом, определяли следующие показатели иммуногистохимической реакции: степень 0 – 0-1 балл; степень 1 – 2-3 балла; степень 2 – 4-6 баллов; степень 3 – 7-8 баллов.

На фронтальных срезах головного мозга с помощью системы анализа изображений (программы «Видеотест-Морфо-4», Россия) определяли морфометрические показатели: абсолютные – среднюю площадь перикарионов нейронов, среднюю площадь ядер нейронов, среднюю площадь цитоплазмы перикарионов нейронов; относительные – удельную площадь перикарионов нейронов и нейропиля, отношение удельной площади перикарионов нейронов к нейропилю, ядерно-цитоплазматическое отношение. Степень выраженности процессов повреждения нейронов определялась методом подсчета удельного количества

________________________________________________________________________

*) Выражаем благодарность заведующему кафедрой биологии ВолгГМУ, д.м.н. Г.Л. Снигуру за помощь в проведении исследования

нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы по методу А.И. Чубинидзе [1972]. При оценке фронтальных срезов в каждой экспериментальной группе изучали не меньше 8 срезов от каждого интересующего отдела головного мозга и исследовали не меньше 120 полей зрения (0,022 мм2) на уровне регионов с признаками наибольших изменений. Размеры нейронов оценивали на выборках, включающих не менее 100 клеток.

Для электронно-микроскопического исследования забор кусочков головного мозга производили из областей, где по данным световой микроскопии наблюдались наибольшие патоморфологические изменения. Фиксацию фрагментов размером 1 мм3 производили в течение 12 часов в 4% растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраоксида осмия на 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4) при температуре +4оС. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации, ацетоне и заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие эпон-аралдитовые срезы толщиной 1 мкм окрашивали метиленовой синью. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротоме LKB-8800. Ультратонкие срезы монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5%-м растворе уранилацетата на 50о этаноле в течение 40 минут и 0,3%-м растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ.

Вариационно-статистическую обработку данных с использованием программ Statistica StatSoft Enterprise 10.0, Microsoft Word Excel 2010. Выборки проверяли на нормальность распределения, в случаях параметрического распределения в качестве критерия достоверности использовался критерий t Стьюдента. Для выборок с отклонением от нормального распределения использовали U-тест Манна-Уитни. Различия при p<0,05 считали статистически значимыми. Для сравнения средних значений параметров использовали однофакторный дисперсионный анализ, в качестве критерия достоверности – критическое значение критерия Фишера. При проведении регрессионного анализа рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона для нормальных распределений и, в случае непараметрических распределений, – коэффициент корреляции Спирмена [Гланц С., 1999; Автандилов Г.Г., 2002].

Результаты исследования и их обсуждение

При экспериментальном моделировании алиментарного дефицита магния к 8-ой неделе эксперимента у животных достигалось достоверное снижение концентрации ионов магния в плазме крови более чем на 40% (с 1,23±0,017 до 0,65±0,017 ммоль/л), в эритроцитах более чем на 50% (с 1,96±0,029 до 0,85±0,014 ммоль/л) и сохранялось на протяжении всего срока эксперимента до 12 недели по сравнению с группой контрольных животных. У животных с дефицитом магния выявлены признаки функциональных изменений в виде снижения спонтанной двигательной активности, ориентировочно-исследовательского поведения, развития депрессивно-подобных реакций. Отмечено достоверное снижение массы тела животных на 19,4% (p<0,05) к 8 неделе и на 27,3% (p<0,05) к 12 неделе эксперимента. У животных группы 2 масса головного мозга составила в среднем 1,83±0,04 г, у животных группы 3 – 1,8±0,05 г, у животных контрольной группы – 1,90±0,05 г.

При моделировании алиментарного дефицита магния на 8-12 неделе наиболее выраженные структурные изменения в головном мозгу в виде увеличения удельного количества «темных» (гиперхромных) нейронов (по Чубинидзе А.И., 1972) наблюдались в крупноклеточных ядрах гипоталамуса, CA1 и CA3 полях гиппокампа, моторной и соматосенсорной коре полушарий большого мозга, ретикулярной формации ствола головного мозга, грушевидных нейронах коры полушарий мозжечка.

При исследовании коры полушарий большого мозга, крупноклеточных ядер гипоталамуса, СА1 и СА3 полей гиппокампа, коры мозжечка структурные изменения проявлялись в виде мозаичного гиперхроматоза и очагового хроматолиза цитоплазмы перикарионов и отростков нейронов при окраске тионином по Нисслю. Удельное количество нейронов с «темной» цитоплазмой (рис. 2, а) в коре полушарий большого мозга в контрольной группе составило 8,4±1,3%, при моделировании дефицита магния 8 недель – 15,6±1,9%, при моделировании дефицита магния 12 недель – 17,9±2,1%; в крупноклеточных ядрах гипоталамуса составило 18,3±2,1% (p<0,001) в группе 2 и 19,6±3,8% (p<0,001) в группе 3 (рис. 2, б).

 Динамика средних удельных морфометрических параметров-0  Динамика средних удельных морфометрических параметров-1  Динамика средних удельных морфометрических параметров головного-2




Рис. 1. Динамика средних удельных морфометрических параметров головного мозга при моделировании дефицита магния.

Примечание: группа 1 – контрольная, группа 2 – дефицит магния 8 недель, группа 3 – дефицит магния 12 недель; а – кора полушарий большого мозга; б – крупноклеточные ядра гипоталамуса; в – поля СА1 и СА3 гиппокампа. На всех диаграммах: столбцы черного цвета – удельная площадь нейронов, %; столбцы светло-серого цвета – удельная площадь нейропиля, %; столбцы темно-серого цвета – удельное количество нейронов с «темной» цитоплазмой, %. * – p<0,05; ** – p<0,001 по сравнению с контролем (ANOVA, критерий Фишера).

Наблюдалось увеличение средней площади перикарионов пирамидных нейронов моторной и соматосенсорной коры большого мозга на 7,8% (при р<0,05) в группе 2 и на 8,3% (при р<0,05) в группе 3 соответственно по сравнению с контрольной группой (рис. 2, а). Отмечалось уменьшение площади перикарионов крупных нейронов (с площадью цитоплазмы перикарионов более 120 мкм2) паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ПВЯ) на 8,4% (р<0,05) в группе 2 и на 9,8% (р<0,05) в группе 3 по сравнению с контрольной группой, где средняя площадь перикарионов нейронов составила 201,1±3,2 мкм2 (рис. 2, б). К 8 неделе моделирования дефицита магния обнаружено уменьшение площади цитоплазмы перикарионов крупных нейросекреторных клеток супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса на 14,8% и 17,1% (р<0,05) соответственно, уменьшение площади цитоплазмы перикарионов пирамидных нейронов CA1 и CA3 полей гиппокампа на 16,1% и 14,4% соответственно (р<0,05). В мелкоклеточной части ПВЯ наблюдалось увеличение средней площади перикарионов нейронов у магний-дефицитных крыс на 11,8% (р<0,05) в группе 2 и на 15,6% (р<0,05) в группе 3 по сравнению с контролем (рис. 2, в). Средняя площадь цитоплазмы перикарионов мелких нейронов увеличивалась на 11,7% (р<0,05) в группе 2 и на 16,9% (р<0,05) в группе 3 (рис. 2, в). Изменения морфометрических параметров нейронов супраоптических ядер гипоталамуса (СОЯ) представлены на рис. 2, г. При исследовании полей СА1 и СА3 гиппокампа средняя площадь перикарионов пирамидных нейронов гиппокампа составила 108,3±5,7 мкм2 при 8-недельном дефиците магния, что на 16,1% (р<0,001) меньше, чем в контрольной группе (рис. 2, д). Аналогичное уменьшение при 12-недельном дефиците магния составило 22,9% (р<0,001). Удельная площадь перикарионов пирамидных нейронов полей CA1 и СА3 гиппокампа при дефиците магния 8 недель также уменьшилась на 16,2% (р<0,05) и на 24,2% (р<0,05) соответственно. При дефиците магния 12 недель обнаруживалась прогрессивная динамика описанных изменений, при этом увеличивалась доля гиперхромных нейронов на 18,3% (р<0,05) по сравнению с контролем и на 3,5% (р<0,01) по сравнению с 8-недельным дефицитом магния (рис. 1, в). При исследовании коры мозжечка, ретикулярной формации ствола головного мозга в группах 2 и 3 с моделируемой магниевой недостаточностью отмечалось увеличение удельного количества нейронов с темной гиперхромной цитоплазмой, вакуолизированными ядрами по сравнению с контролем; удельное их количество составило 23,2% (р<0,05) в группе 2 и 28,4% (р<0,05) в группе 3. При проведении регрессионного анализа установлены прямые сильные корреляционные связи между уменьшением площади перикарионов крупных нейронов гипоталамуса (r=0,99 при р<0,05) и снижением содержания ионов магния в эритроцитах.

В нейропиле описываемых областей головного мозга при дефиците магния к 12 неделе эксперимента выявлялись набухшие глиоциты с дистрофическими изменениями, явления нейронофагии, апоптозные тельца. Наблюдались периваскулярный и перицеллюлярный отек, стазы эритроцитов в капиллярах и венулах. При исследовании экспрессии каспазы 3 в эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов микроциркуляторного русла значимых отличий не было выявлено.

При иммуногистохимическом исследовании в группах 2 и 3 с использованием антител к белку TRPM6 отмечалась более выраженная (степени 2-3 по полуколичественной визуально-аналоговой шкале Allred D.C., 1998) по сравнению с контролем (степень 0-1) диффузная экспрессия в виде относительно равномерного глыбчатого накопления иммунореактивного материала в цитоплазме перикарионов и ядерных оболочках большинства нейронов всех слоев первичной и вторичной моторной коры, нейронов крупно- и мелкоклеточной части ПВЯ, нейронов СОЯ, грушевидных нейронов коры мозжечка. В глиальных клетках моторной и соматосенсорной коры полушарий большого мозга экспрессия TRPM6 была минимальна или отсутствовала (степень 0-1) во всех экспериментальных группах, в то время как в ПВЯ и СОЯ, гиппокампе, ретикулярной формации ствола головного мозга, коре мозжечка при дефиците магния она усиливалась (степень 1-2) по сравнению с контролем (степень 0). В эндотелии сосудов микроциркуляторного русла и гладких миоцитах артериол описываемых областей головного мозга отмечалось увеличение цитоплазматической экспрессии белка-транспортера магния TRPM6 в группах 2 и 3 (степень 1-2) по сравнению с контролем (степень 0).

При иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к TRPM7 в опытных группах (2 и 3) в отличие от контроля (равномерная, слабо выраженная цитоплазматическая экспрессия в нейронах и глиоцитах, степень 0-1) отмечалось умеренное и выраженное (степени 2-3) мозаичное окрашивание цитоплазмы перикарионов и отростков нейронов первичной и вторичной моторной коры полушарий большого мозга, ганглионарного слоя коры мозжечка, крупноклеточных ядер гипоталамуса, пирамидных нейронов СА1 и СА3 полей гиппокампа, нейронов ретикулярного гигантоклеточного ядра; при этом встречалось около 25-30% нейроцитов с иммунонегативной реакцией. В цитоплазме перикарионов грушевидных нейронов наблюдалось нехарактерное для контрольной группы грануло-вакуолярное накопление иммунопозитивного материала в непосредственной близости к контуру цитоплазматической мембраны. Ядра и ядрышки большинства нейроцитов были слабо иммунопозитивными или негативными. Иммунонегативные нейроны располагались среди интенсивно окрашенных клеток с четкой перинуклеарной зоной просветления, что создавало своеобразную мозаичную картину. В нейропиле указанных областей отмечалось диффузное равномерное слабо выраженное накопление иммунореактивного материала во всех группах. В эндотелии сосудов микроциркуляторного русла и гладких миоцитах артериол при дефиците магния в гиппокампе и гипоталамусе наблюдалось выраженное усиление цитоплазматической экспрессии белка-транспортера магния, TRPM7, в виде диффузного накопления иммунопозитивных гранул.

При иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к e-NOS в опытных группах в коре полушарий большого мозга, гиппокампе и крупноклеточных ядрах гипоталамуса отмечалось преобладание нейронов, глиоцитов, эндотелиоцитов сосудов микроциркуляторного русла и гладкомышечных клеток артериол цитоплазматическая экспрессия была слабой или отсутствовала (степень 0-1) в отличие от контроля (степень 2). В нейронах Пуркинье коры мозжечка и

 Динамика средних абсолютных морфометрических-3  Динамика средних абсолютных морфометрических-4
 Динамика средних абсолютных морфометрических-5  Динамика средних абсолютных морфометрических параметров-6
 Динамика средних абсолютных морфометрических параметров-7  Динамика средних абсолютных морфометрических параметров-8


Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 




Похожие работы:







 
2013 www.деньсилы.рф - «МЕДИЦИНА-ЛЕЧЕНИЕ-ОЗДОРОВЛЕНИЕ»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.